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检测组蛋白修饰活性的HTRF甲基转移酶测定的小型化

邦妮·爱德华兹(1)卡尔·彼得斯(2) (1) Labcyte (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 04/2015
  • 分析的小型化能够高通量筛选影响表观遗传学的化合物
  • 良好的数据质量(Z´> 0.88)仅在2µl检测体积

介绍

组蛋白修饰酶是药物开发和癌症研究中重要的表观遗传靶点。一些有趣的酶是甲基转移酶。它们的活性导致甲基化组蛋白,从而影响基因转录的调控。甲基通常由SAM (s - adenoyl - l- methionine)提供。SET7/9是一种甲基转移酶,它利用SAM作为辅助因子来甲基化组蛋白H3。通过这种方式,SET7/9能够调节人类癌细胞系中的p53活性,表明该酶在人类肿瘤形成过程中的重要性。


在本应用笔记中,我们展示了Cisbio的表观甲基转移酶检测试剂盒的使用。HTRF技术的同质方法使试剂盒能够用于高通量筛选目的。为了限制相关成本,进行了小型化以显著降低测定量。这需要非常精确的仪器,并在Labcyte的Echo liquid处理器的帮助下进行,该处理器使用声波分配(低至2.5 nl)来精确转移试剂盒试剂、酶、底物和化合物。

测定原则

该测定由两个步骤组成。在酶促步骤中,将基质与化合物存在于酶的情况下。添加辅子Sam以开始反应。结果将是甲基化底物,而SAM被转化为SAH(S-腺苷-1-同型半胱氨酸)。在第二步中,添加含有抗体对SAH的抗体的检测试剂。用Lumi4-Tb加密标记抗体。加入该D2偶联的SAH,其与在反应期间形成的SAH与抗体结合位点(图1)相竞争。

材料与方法

  • Cisbio的表观甲基转移酶检测试剂盒
  • 384孔白色,低体积测定板来自Greiner
  • 来自康宁公司的1536孔白色实验板
  • BPS生物科学专业7/9分
  • 生物素化组蛋白H3(1-21)来自AnaSpec
  • (R)-来自Tocris Biosciences的pfi 2盐酸盐
  • Sigma-Aldrich的SAM和SAH
  • 回声®Labcyte的液体处理器
  • PHERAstar®FS.microplate reader来自BMG 德赢vwin官网客服LABTECH

试剂准备
SAM溶解于5mm H2所以4./10%乙醇(v/v)溶于水中,配制成30mm溶液。测定缓冲液为50 mM TRIS-HCL pH 8.8, 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.01% Tween-20。HTRF检测缓冲液1、2在室温下解冻即可使用。


标准曲线
对于预测试目的,制定了SAM / SAH标准曲线。这些标准曲线模拟了酶反应中的甲基转移。在测定缓冲液中制备16标准,从1μmsah(1:2稀释)开始。将每种稀释率的三倍体转移到384孔或1536孔微孔板中。加入检测试剂并在60分钟孵育后,在Pherastar中读出平板FS.


酶滴定
半对数稀释SET7/9滴定曲线在回声合格的384孔源板中制备。将400 nl不同浓度的酶分3次转移到384孔的实验板上。加入200 nl检测缓冲液、200 nl 800 nM生物素化组蛋白、200 nl 1µM SAM,封板,室温孵育60 min,孵育后加入检测缓冲液1停止酶促反应。再孵育10分钟后,加入检测缓冲液2制备的抗sah lumi-Tb cryptate和SAH-d2。在最后60分钟的孵育步骤后,在pherstar中读取微孔板FS.

抑制剂剂量响应曲线
在DMSO中制备Set7 / 9抑制剂(R)-PFI 2盐酸盐的12点半对数剂量响应系列,以最高浓度为100μm。将抑制剂转移到384孔和1536孔板中,然后进行测定缓冲液,40nM酶,800nm生物素化的组蛋白和1μm。所有反应和孵育步骤如所述酶滴定描述。在NAL孵育后,在Pherastar中测量微孔板FS.

所有的转移和移液步骤都是使用Echo液体处理器完成的。


PHERAstarFS.仪器的设置

检测模式: TRF,终点
光学模块: HTRF 337 665 620
集成开始时间: 60µ年代
积分时间: 400μs.

成绩与讨论

在图1中。示出了SAM / SAH标准曲线,其在384孔或1536孔格式中测量。结果表明,测定适用于不同的平板形式。还表明,可以使用多达1.25μL的固定体积。

完成SET7 / 9酶滴定以使其成为最佳酶浓度。图3显示了滴定结果。从该酶浓度为40nm的酶浓度是最佳用于随后的实验。

对于SET7/9抑制剂IC50可以从抑制剂剂量响应曲线计算值(图4)。

测定的小型化非常成功,通过优异的数据质量表明。小型化测定的Z'因子> 0.88,并且对标准20μL测定的测定参数非常好(表1)。


表1:Z´因子和信号与背景(SIB)的比较。

测定格式 S / B Z'Factor.
384孔(20μl) 6.4 0.83
384 -(2µl) 7.9 0.88
1536 -(2µl) 7.3 0.93

结论

SET7/9甲基转移酶检测可以小型化10倍,显著节省试剂、酶、底物和化合物的成本。

Lumi4是Lumiphore Inc.的商标。
HTRF是Cisbio的注册商标。

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