线粒体氧化剂一代遵循缺氧和重新氧合

介绍

酵母是一种常见的模式生物，因为它易于基因改造，对不同的环境有很强的适应性，是一种真核生物。酵母可以在好氧条件下被放在琼脂板上进行研究。Singer仪器转子装置引脚菌落酵母，真菌或细菌在96,384或1536平板格式琼脂板，使研究菌落在高通量。在这里，不同的酵母克隆被固定在一个有384个测量点的平板上，以确定有机体对不同氧浓度的反应。CLARIOstar微孔板阅读器检测了酵母自身荧光、mCherry报告的柠檬酸合成酶2表达以及基于氧化还原敏感的罗格fp2探针的差异。

测定原则

表达mito-roGFP2-Tsa2的酵母克隆_R，线粒体氧化还原敏感传感器¹将未修饰的酵母用转子(辛格乐器)固定在琼脂板上，其布局类似于384孔板。rofp2探针在H的作用下改变其激发谱₂O₂：氧化探针在405nm处可激发，并且在488nm处的形式减少。氧化和降低信号的比例用于报告探针的氧化状态。除了线粒体氧化还原探针之外，酵母细胞表达了用MCHerry表示柠檬酸合酶2（Cit2）融合蛋白。在激活逆行途径后，Cit2上调，是线粒体功能障碍的常见标记。为了校正酵母菌菌落的生长，获得酵母NAD（P）H的自动流荧光。

材料与方法

• 酵母细胞(菌株BY4742)与基因组整合的roGFP2-Tsa2∆C_R以及内源性Cit2 c端mcherry - fusion tag
• 用酵母菌落固定在空盘子里的合成琼脂(带有96块垫的转子机器人，歌手乐器)
• Clariostar Microplate Reader，B德赢vwin官网客服MG Labtech

实验的程序
将酵母细胞固定后，在30℃下培养24小时，然后将其暴露于变化的环境氧浓度中，如图1所示。试验设24个重复。琼脂仅作为空白和未经修饰的酵母菌落作为阴性对照。

仪器的设置

顶部读取，闪光号码：	40
焦点：	7.0
解决时间:	0.1

罗格fp2(过滤器测量)

激发1（氧化Rogfp2）：	400 - 10
激发2(还原罗格fp2):	482 - 16
二向西：	LP504
排放:	520 - 10
收益:	691(例1);504(例2)

NAD（P）H自发荧光（LVF单色仪）

激励:	340-15
二向西：	汽车393.8
排放:	460 - 20
收益:	1376

Cit2-MCHERRY（LVF单色仪）

激励:	570-15
二向西：	自动：593.8
排放:	620-20.
收益:	2780.

成绩与讨论

酵母暴露于不同水平的氧(图1)和线粒体氧化还原探针的氧化还原状态进行了研究。在氧气从18%下降到12%的初始阶段(0 ~ 1.2 h)，线粒体h的氧化还原状态₂O₂探头不受氧下降的影响²。这可以解释为，在氧浓度波动的情况下，相对于细胞质，更有利于线粒体的供氧。在较低的氧饱和度下，减少的探针数量随着罗格fp2比率的降低而增加。当氧保持在1%(5-6.5小时)时，探针继续以其还原形式存在，只在再氧化阶段被氧化。一旦有更多的氧气，立即进行探针氧化，进一步表明线粒体供氧的高度优先性。

抑制线粒体呼吸引起的途径是逆行途径。报告细胞核线粒体衰竭。其中一种被激活的蛋白质是Cit2。

在缺氧过程中，Cit2的表达略有减少，而在再灌注过程中则显著增加(图3)。Cit2的增加是由于再灌注所致还是由于对缺氧的延迟反应，还有待进一步研究。