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线粒体氧化剂一代遵循缺氧和重新氧合

丹尼尔·帕斯特-弗洛雷斯·托拜厄斯·迪克 德国癌症研究中心(DKFZ),德国德罗吉划分(A160) 08/2017
  • 测量荧光酵母菌落琼脂
  • 使用Clariostar探讨常氧和缺氧条件®带大气控制单元(ACU)的读数器
  • 测量采用LVF单色仪的灵活性的多个参数TM

概要

酵母是一种常见的模式生物,因为它易于基因改造,对不同的环境有很强的适应性,是一种真核生物。酵母可以在好氧条件下被放在琼脂板上进行研究。Singer仪器转子装置引脚菌落酵母,真菌或细菌在96,384或1536平板格式琼脂板,使研究菌落在高通量。

在这里,不同的酵母克隆被固定在一个有384个测量点的平板上,以确定有机体对不同氧浓度的反应。这些浓度产生于www.v66088.com 测量室由其大气控制单元(ACU)。微板阅读器检测酵母自身荧光、mCherry报告的柠檬酸合成酶2表达和基于氧化还原敏感的罗格fp2探针的差异。

介绍

酵母是一种常见的模式生物,因为它易于基因改造,对不同的环境有很强的适应性,是一种真核生物。酵母可以在好氧条件下被放在琼脂板上进行研究。Singer仪器转子装置引脚菌落酵母,真菌或细菌在96,384或1536平板格式琼脂板,使研究菌落在高通量。在这里,不同的酵母克隆被固定在一个有384个测量点的平板上,以确定有机体对不同氧浓度的反应。CLARIOstar微孔板阅读器检测了酵母自身荧光、mCherry报告的柠檬酸合成酶2表达以及基于氧化还原敏感的罗格fp2探针的差异。


测定原则

表达mito-roGFP2-Tsa2的酵母克隆R,线粒体氧化还原敏感传感器1将未修饰的酵母用转子(辛格乐器)固定在琼脂板上,其布局类似于384孔板。rofp2探针在H的作用下改变其激发谱2O2:氧化探针在405nm处可激发,并且在488nm处的形式减少。氧化和降低信号的比例用于报告探针的氧化状态。除了线粒体氧化还原探针之外,酵母细胞表达了用MCHerry表示柠檬酸合酶2(Cit2)融合蛋白。在激活逆行途径后,Cit2上调,是线粒体功能障碍的常见标记。为了校正酵母菌菌落的生长,获得酵母NAD(P)H的自动流荧光。

材料与方法

  • 酵母细胞(菌株BY4742)与基因组整合的roGFP2-Tsa2∆CR以及内源性Cit2 c端mcherry - fusion tag
  • 用酵母菌落固定在空盘子里的合成琼脂(带有96块垫的转子机器人,歌手乐器)
  • Clariostar Microplate Reader,B德赢vwin官网客服MG Labtech

实验的程序
将酵母细胞固定后,在30℃下培养24小时,然后将其暴露于变化的环境氧浓度中,如图1所示。试验设24个重复。琼脂仅作为空白和未经修饰的酵母菌落作为阴性对照。

仪器的设置

顶部读取,闪光号码: 40
焦点: 7.0
解决时间: 0.1


罗格fp2(过滤器测量)

激发1(氧化Rogfp2): 400 - 10
激发2(还原罗格fp2): 482 - 16
二向西: LP504
排放: 520 - 10
收益: 691(例1);504(例2)


NAD(P)H自发荧光(LVF单色仪)

激励: 340-15
二向西: 汽车393.8
排放: 460 - 20
收益: 1376


Cit2-MCHERRY(LVF单色仪)

激励: 570-15
二向西: 自动:593.8
排放: 620-20.
收益: 2780.

成绩与讨论

酵母暴露于不同水平的氧(图1)和线粒体氧化还原探针的氧化还原状态进行了研究。在氧气从18%下降到12%的初始阶段(0 ~ 1.2 h),线粒体h的氧化还原状态2O2探头不受氧下降的影响2。这可以解释为,在氧浓度波动的情况下,相对于细胞质,更有利于线粒体的供氧。在较低的氧饱和度下,减少的探针数量随着罗格fp2比率的降低而增加。当氧保持在1%(5-6.5小时)时,探针继续以其还原形式存在,只在再氧化阶段被氧化。一旦有更多的氧气,立即进行探针氧化,进一步表明线粒体供氧的高度优先性。

抑制线粒体呼吸引起的途径是逆行途径。报告细胞核线粒体衰竭。其中一种被激活的蛋白质是Cit2。


在缺氧过程中,Cit2的表达略有减少,而在再灌注过程中则显著增加(图3)。Cit2的增加是由于再灌注所致还是由于对缺氧的延迟反应,还有待进一步研究。

结论

将酵母或细菌固定在标准SBS格式的琼脂板上,可以在高通量格式中研究菌落。钉住的菌落可以使用荧光标记进行分析,荧光标记可在像CLARIOstar这样的微孔板阅读器上读取。该装置的设计满足了两种需求:灵活性和灵敏度。灵活性是通过LVF单色仪实现的,允许选择任何波长和带宽。使用滤波器可以增强系统的非凡灵敏度。这样可以最大限度地得到实验的输出,如图所示:氧化还原态,H2O2NAD(P)H自发荧光。


参考资料

1.Bruce Morgan等(2016)实时监测基础H2O2基于过氧杂志的探针自然化学生物学12,437-443(2016)DOI:10.1038 / Nchembio.2067
2.牧师弗洛雷斯D.,Dick T.(2017)监测酵母线粒体用过量氧中的氧化还原探针 - 氧气和葡萄糖可用性的流动。接口焦点,DOI:10.1038 / Nchembio.2067

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