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基于分子信标基的螺旋酶测定

Alicia M. Hanson(1)David N. Frick(1)Carl Peters(2) (1)威斯康星大学 - 密尔沃基(2)BMG Labtech德赢vwin官网客服 06/2013
  • 对解旋酶催化分离荧光标记DNA进行了监测
  • BMG 德赢vwin官网客服Labtech微孔板读卡器用于监测荧光和注射ATP
  • MARS数据分析软件用于计算IC50.价值

介绍

螺旋酶是结合双链核酸的电机蛋白,以便分离和/或重新排列它们。通过腺苷三磷酸酯(ATP)来燃料反应。由细菌,病毒和哺乳动物的基因组编码的螺旋酶在过程中具有多样化的功能,包括DNA复制和修复,RNA转录和翻译。螺旋酶在维持病毒和病原体感染中的重要性使螺旋酶具有吸引力的药物靶标。需要鉴定螺旋酶的小分子抑制剂。为此目的,分子信标直升机测定(MBHA)被开发为改进的螺旋酶测定。


本应用说明书描述了如何进行MBHA,以确定潜在抑制剂对丙型肝炎病毒(HCV) NS3解旋酶(一种广泛研究的解旋酶模型和药物靶标)编码的解旋酶活性的影响。荧光双链DNA底物与BMG LABTECH微孔板阅读器和MARS数据分析软件结合使用。德赢vwin官网客服

测定原则

在MBHA中,退火基材的两个核苷酸链是分子信标,即在分离时形成茎环结构。核酸链中的一种在任一端具有猝灭剂和荧光团,使得在杆环在链分离后形成杆环时呈现两个。因此,在测定的开始处获得高荧光信号,并且随着螺旋酶展开基板的随后减少。如果存在抑制化合物,则保持荧光。

MBHA还可以通过吸收或发射波长类似Cy5的光来检测干扰实验的小分子。相对于阴性对照(如仅dmso),干扰化合物要么增强荧光,要么降低荧光。因此,MBHA是测定小分子解旋酶催化DNA解缠绕抑制作用的理想工具。

材料与方法

  • 白色,96孔,半区域微孔板(康宁)
  • 微孔板读者配备了来自BMG Labtech的喷射器德赢vwin官网客服
  • 单股5 '端携带花青素5和3 '端携带IAbRQ quencher的DNA核苷酸购自Integrated DNA Technologies

如前所述进行HCV旋光酶的表达和纯化。


退火DNA链以产生CY5-MBHA底物。100nm Cy5-MBHA底物的工作原料在25mM MOPS,pH6.5中制备。将潜在的直升机抑制剂(化合物B,C和D)溶解在DMSO和8点,产生2倍稀释系列。


反应条件为:25 mM MOPS pH 6.5, 1.25 mM MgCl2, 12.5 nM NS3解旋酶,5 μg/mL BSA, 0.001% (v/v) Tween20, 50 μM DTT, 5 nM Cy5-MBHA底物,5% DMSO,不同浓度的化合物,1 mM ATP,最终体积60 μL。将除抑制剂和ATP外的所有组分加入到微孔板中。随后,抑制剂以1:20的比例添加,最终DMSO浓度为5%。以5% DMSO和100 μM primuline (MP生物制剂)作为阳性和阴性对照。使用BMG LABTECH荧光平板阅读器读取平板。德赢vwin官网客服

仪器设置

测量方法: 荧光强度,顶视音
阅读模式: 板模式动力学
过滤器: 640-10 / 680-10
不。周期: 90-250
周期: 5-20秒
注射: 后10 - 20周期

使用阴性控制孔(DMSO添加)将增益设定为85%。在1:10比率(使用1mm最终,智能分配)的机器注入ATP之前,读取纸张大约2分钟,然后读取总计约半小时。请注意,循环时间,闪烁数量和周期数变化。应努力收集许多质量数据点。应调整这些设置以在读取不同数量的井时保持测定时间。另请注意,这些缓冲条件针对该特定酶进行了优化。测定条件应针对其他酶进行优化。

成绩与讨论

使用BMG Labtech微孔板读卡器在96孔中进行了几种MBHA以确定IC德赢vwin官网客服50.抑制三种已知的HCV旋光酶抑制剂(化合物B,C和D)。


通过首先在信号曲线(图2中的范围2中,蓝色虚线盒)中首先定义“线性范围”,通过首先定义“线性范围”,通过第一定义“线性范围”。

MARS的动力学计算特征用于确定线性范围的斜率,其近似于酶解绕的初始速率。使用MAR中的重新计算的浓度函数,完成对数抑制剂浓度的4个参数拟合以产生标准曲线(图3)。从这些曲线ic inc50.表示表示抑制50%的螺旋酶活性所需的化合物浓度的值。

为了判断复合干扰,将ATP加法(范围1图2)之前每次反应的平均荧光与单独在载体(DMSO)存在下进行的反应的平均荧光。这里显示的化合物都没有干扰测定。在其他地方描述了与DNA结合复合化合物橙的混合MBHA的化合物的实例。


结论

该报告表明,BMG Labtech微孔板读取器的荧光模式可用于通过Helicase酶追随双链DNA底物的展开。德赢vwin官网客服我们还展示了如何使用BMG Labtech德赢vwin官网客服 MARS数据分析软件来计算IC50.抑制。

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