199

使用BMG Labtech微孔板读卡器监测细菌细胞 - 细胞通信“Quorum感测”德赢vwin官网客服

K.E. Eboigbodin G.K. Robinson 肯特大学生物科学系 08/2009
  • 法定感测是一种允许细菌适应环境变化的现象
  • 对效果群体感应通过测量生物发光和细菌生长来研究
  • Flyostar.®Optipa用于平行测量吸光度和发光

介绍

细菌可以通过称为仲裁感测(QS)的细胞密度过程来监测和响应对环境条件的变化。细菌利用该过程通过产生,检测和响应低分子质量信号分子,称为Auculucucers(AI)来监测其社区。当细胞密度增加这些信号传导分子的浓度也将增加。一旦这些分子的积累达到阈值,细菌统称能够调节基因表达,因此协同调节其代谢行为。已经证明了致法感测量在细菌中调节各种过程。这些包括生物发光和共生vibriofischeri.,毒力基因的表达铜绿假单胞菌,毒力表达,表面蛋白和生物膜的形成大肠杆菌细胞外聚合物的生物合成和致病性欧文氏菌stewartii。两种主要类型的仲裁感测分子(QSMS)已广泛描述于文献中。革兰氏阴性细菌使用的最常见的QSM被称为N-酰基均静脉内酯(HSL),而革兰氏阳性细菌使用氨基酸和短肽(寡肽)作为其AIS。

群体感应最先在V.Fischeri.,革兰氏阴性细菌。在低细胞密度下,vibriofischeri.是非生物发光,但当浓度增加(高细胞密度),有机体是生物发光。生物发光调控的分子基础V.Fischeri.通过Quorum感测已经很好地研究过。负责光源的基因集群由八个基因组成(Luxa-e,Luxg,Luxi和Luxr)(图1)。

这种生物中负责群体感应的调节蛋白是由luxI和luxR编码的蛋白。LuxI编码AHL合成酶,它催化参与HSLs生物合成的反应n -3-oxo-hexanoyl- l-高丝氨酸内酯(3-oxo-C6-HSL)。LuxR编码与人工智能结合的蛋白质,并激活luxA-E和luxI操纵子。


本研究的目的是阐明生长介质等环境条件的改变以及3-oxo-C6-HSL上外源高丝氨酸内酯的添加对其生长和生物发光的影响V.Fischeri.。用B德赢vwin官网客服MG LABTECH微孔板阅读器在脚本模式下测量吸光度和发光度。

材料与方法

细菌菌株和培养基
V.Fischeri.ESR1及其突变体由Edward G. Ruby教授提供。ESR1变体包括不合成3-氧代-C6-HSL信号的信号阴性突变体,但仍然可以响应外源3-氧代-C6-HSL(V.Fischeri.KV240)和一株能产生3-oxo-C6-HSL但对3-oxo-C6-HSL无反应的信号盲菌株(V.Fischeri.KV267)。


所有V.Fischeri.菌株生长在Luria-Bertani盐媒体(磅),它包含1% (wt /卷)胰蛋白胨,0.5% (wt /卷)酵母提取物(wt /卷),2%氯化钠(wt /卷),和0.3%(卷/期)甘油在50 mM Tris-HCl (pH值7.5)或在海水中胰蛋白胨(SWT)含有0.5% (wt /卷)胰蛋白胨,0.3% (wt /卷)酵母提取物,0.3%的甘油(卷/期)70%的海水。

评估V.Fischeri.不同培养基下的生长和生物发光和均静脉内酯的浓度
所有生物的生长和发光V.Fischeri.使用来自BMG Labtech的多模板读卡器监测菌株。德赢vwin官网客服简而言之,过夜文化V.Fischeri.在28℃下在上述培养基中生长的菌株接种到新鲜培养基(1:500稀释),或者不添加外源3-氧代-C6-HSL。然后将200μl稀释的细胞(四丙烯酸盐)转移到白色96孔透明底部微孔板(Greiner Bio-One)中。


仪器孵育温度设置为28°C,持续震动300 rpm。的OD600然后每小时测量一次发光,持续至少16小时V.Fischeri.报告了生物发光读数作为相对光线(RLU)除以OD600

成绩与讨论

随着时间的推移,细胞数量的增加V.Fischeri.在LBS和SWT中生长的菌株可以在图2中观察到。生长曲线在批量条件下表示典型的生长曲线,其中两个明显不同的相位是指数2-8h,8小时后的静止阶段发作。


每种菌株之间没有显着差异,表明Quorum感应V.Fischeri.不促进或抑制生长。

生物发光的表达V.Fischeri.ESR1在LBS和SWT中培养(含或不含3-oxo- c6 - hsl)分别见图3和图4。为V.Fischeri.ESR1,SWT的生物发光比LBS更高。当加入外源3-氧代C6-HSL时,观察到早期的生物发光激活V.Fischeri.ESR1在生长开始。为V.Fischeri.KV240,只有在生长开始时加入外源3-oxo-C6-HSL才能观察到生物发光。这说明该菌株缺乏内源性3-oxo-C6-HSL的产生能力,只有添加外源性3-oxo-C6-HSL才能表达生物发光。如预期的那样,V. fischeri KV267在添加外源3-oxo-C6-HSL或不添加外源3-oxo-C6-HSL时均能表达生物发光,因为它缺乏对信号分子的响应能力。

结论

在这项研究中,我们表明BMG LABTECH微孔板阅读器德赢vwin官网客服是理解细菌群体感应的有用工具。该仪器能够同时监测微生物的生长和生物发光。

去顶级