297.

用homoFRET-FP检测活细胞中胰岛素颗粒包装

易N.Y. (1) Q. He (1) T.B. Caligan (1) G.R. Smith (1) L.J. Forsberg (2) J.E. Brenman (2) j.z. Sexton (1) (1)北卡罗来纳中央大学(2)Unc Chapel Mill医学院 07/2016
  • 在胰岛素颗粒密集的范围内,homoFRET可以发生,极化信号的变化可以检测到
  • 使用Pherastar的Live Cells中的FP测量®标仪

表的内容

介绍

糖尿病的特征在于破坏正常代谢的破坏,这些代谢源于耐胰岛素或胰岛素分泌不良1。2014年据报道,近10%的美国人口患有糖尿病,90%的糖尿病病例是2型糖尿病2,3。由于这种疾病的高发病率和与治疗相关的同样高的经济负担,寻找新的治疗方法仍然是一个重点。


如图1中所列出的多个步骤调节生理活性胰岛素的分泌。这些步骤中的每一个都代表治疗干预的机会4

测定原理

本申请说明描述了一种高通量筛选兼容的基于细胞的测定,其使用预胰岛素-MCHerry(PPI-MCHERRY)系统。该应用程序利用该事实:当FL uoroOrophore处于高局部浓度时,可能会在相同类型的流体中发生。这种现象称为同性恋(HF)。此外,如果施加偏振光作为激发光,则随着HF在相邻的流量之间发生时,它将随机化。有人推出,HF-FP方法适合于监测成熟胰岛素填充成致密核心颗粒的程度(图2)。

材料与方法

  • 384孔黑色/透明底板(Nunc#152029)
  • 大鼠胰岛素瘤(INS-1)细胞由杜克大学的Christopher Newgard捐献
  • 胰岛素原前(PPI) mCherry报告基因构建是在UNC的Brenman博士的实验室完成的
  • fda批准的1,280分子药物(普雷斯特维克化学文库)
  • 502纯度天然产品(Enzo Life Sciences)
  • BMG Labtech的Pherastar Microplate读德赢vwin官网客服卡器

将用PPI-MCHERRY转染的INS-1细胞生长48小时,然后暴露于指定的浓度的激动剂/拮抗剂4小时。

Pherastar仪器设置

测量类型: 荧光偏振
测量模式: 终点
光学模块: FP (590 - 50/675 50/675 - 50)
获得: 在试运转前调整
目标MP值: 400
焦高度: 7.2
闪光/: 200.

结果与讨论

为了验证HomoFret-FP方法,用Ba Fi Lomcycin处理细胞,真空型H处理+已知atp酶(V-ATPase)抑制剂可以阻止液泡成熟,从而阻止胰岛素颗粒的形成(图3)。结果表明,增加巴非霉素浓度导致mP值增加,与颗粒形成减少相关。

在随后的实验中,83 nM的巴非霉素作为阳性对照,DMSO阴性对照。用2个不同的化合物库进行了初步筛选。这些实验结果表明,Z’-因子表明该方法确实适用于高温热休克试验。此外,有26种化合物显示出活性(图4)。

图5显示了从导频屏幕中的三次命中的代表性配置。总体而言,屏幕射门击中率为1.4%,确认率为36.4%。

结论

这些结果建立了一种基于细胞的FP生物传感器,以鉴定改性胰岛素颗粒包装的化合物。该技术可以作为评估活细胞系统中蛋白质 - 蛋白质相互作用的新方法。


参考文献

1.Rorsman P等(2000)双相胰岛素分泌的细胞生理学。新闻杂志。Sci 15:72 - 77。
2.疾病控制和预防中心(CDC)(2014)国家糖尿病统计报告。
3.Huang CJ等(2007)人胰岛淀粉样多肽的高表达率诱导内质网应激介导的细胞凋亡,这是2型糖尿病而非1型糖尿病患者的特征。糖尿病56(8):2016 - 2027。
4.Yi NY等人(2015)开发了一种基于细胞的荧光偏振生物传感器,使用胰岛素前体来识别改变胰岛素颗粒动力学的化合物。试验药物。开发技术13(9):558-569。

去前