用homoFRET-FP检测活细胞中胰岛素颗粒包装

介绍

糖尿病的特征在于破坏正常代谢的破坏，这些代谢源于耐胰岛素或胰岛素分泌不良¹。2014年据报道，近10％的美国人口患有糖尿病，90％的糖尿病病例是2型糖尿病^2,3。由于这种疾病的高发病率和与治疗相关的同样高的经济负担，寻找新的治疗方法仍然是一个重点。

如图1中所列出的多个步骤调节生理活性胰岛素的分泌。这些步骤中的每一个都代表治疗干预的机会⁴。

测定原理

本申请说明描述了一种高通量筛选兼容的基于细胞的测定，其使用预胰岛素-MCHerry（PPI-MCHERRY）系统。该应用程序利用该事实：当FL uoroOrophore处于高局部浓度时，可能会在相同类型的流体中发生。这种现象称为同性恋（HF）。此外，如果施加偏振光作为激发光，则随着HF在相邻的流量之间发生时，它将随机化。有人推出，HF-FP方法适合于监测成熟胰岛素填充成致密核心颗粒的程度（图2）。

材料与方法

• 384孔黑色/透明底板（Nunc＃152029）
• 大鼠胰岛素瘤(INS-1)细胞由杜克大学的Christopher Newgard捐献
• 胰岛素原前(PPI) mCherry报告基因构建是在UNC的Brenman博士的实验室完成的
• fda批准的1,280分子药物(普雷斯特维克化学文库)
• 502纯度天然产品（Enzo Life Sciences）
• BMG Labtech的Pherastar Microplate读德赢vwin官网客服卡器

将用PPI-MCHERRY转染的INS-1细胞生长48小时，然后暴露于指定的浓度的激动剂/拮抗剂4小时。

Pherastar仪器设置

测量类型：	荧光偏振
测量模式：	终点
光学模块:	FP (590 - 50/675 50/675 - 50)
获得:	在试运转前调整
目标MP值：	400
焦高度:	7.2
闪光/:	200.

结果与讨论

为了验证HomoFret-FP方法，用Ba Fi Lomcycin处理细胞，真空型H处理⁺已知atp酶(V-ATPase)抑制剂可以阻止液泡成熟，从而阻止胰岛素颗粒的形成(图3)。结果表明，增加巴非霉素浓度导致mP值增加，与颗粒形成减少相关。

在随后的实验中，83 nM的巴非霉素作为阳性对照，DMSO阴性对照。用2个不同的化合物库进行了初步筛选。这些实验结果表明，Z’-因子表明该方法确实适用于高温热休克试验。此外，有26种化合物显示出活性(图4)。

图5显示了从导频屏幕中的三次命中的代表性配置。总体而言，屏幕射门击中率为1.4％，确认率为36.4％。