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激光肾小管测量监测微生物生长曲线

Sven Brand Christian Rückert 比勒费尔德大学 07/2004
  • 微生物生长监测48小时,重现性很大
  • 在灵敏度方面,浊度法明显优于浊度法
  • 吸光度与浊度测量之间的良好相关性

介绍

临床免疫学和药物发现的不同分析方法利用了基于光散射的两个密切相关的技术。


浊度是通过悬浮颗粒透射的光的测量。它需要相对较高的粒子和奥贝罗斯啤酒法。相反,肾小序测定是通过以直角悬浮在溶液中悬浮在梁的颗粒的光,或者优选地以向前角度测量散射光的直接方法。在稀释溶液中,在吸收和反射最小的情况下,散射光的强度是散射颗粒浓度的函数。


基于激光的微孔板格式最常见的基于激光的尼鲷来说是HTS实验室的全自动溶解度屏幕。确定含水化合物溶解度已成为药物发现过程中的必要早期测量,以避免低溶解度化合物的耗时和昂贵的Ade筛选。


在临床化学中,Nephelometry用于测定血清免疫球蛋白(IgA,IgG,IgM),补体组分(C3,C4),急性相反应物蛋白(CRP,转移素),白蛋白和A-1-抗抗胰蛋白酶。球状蛋白质的蛋白质沉淀是指通过加入盐(硫酸铵),有机溶剂(丙酮),有机聚合物(PEG)或三氯乙酸来形成蛋白质聚集体。相反,免疫沉淀允许给定的蛋白质通过抗体 - 抗原反应选择性地沉淀。


在有机化学中,比浊法用于量化大分子,例如监测聚合反应。

材料与方法

作为常见的基于比色皿的仪器BMG Labtech提供了唯一基于激光的微孔板Nephelometer,Nephelos德赢vwin官网客服tar®,它通过前向光散射检测微孔内的颗粒物质(光学设计如图1所示)。


霞石星的光源是一个红色激光二极管(633 nm),提供可调的强度和光束直径,以减少弯月效应和优化的灵敏度,甚至允许测量384孔板格式。仪器的灵活性进一步增强了内置的两个试剂喷射器,精确的温度控制,多模式振动能力,自动增益调整,和一个机器人板载体。

下面描述了通过连续监测补充有不同硫来源的培养基的微生物生长来分析谷氨酸谷氨酸野生型和不同缺失突变体的生长阶段调节的快速敏感的方法。CoryneDebacterium谷氨酰胺是一种革兰氏阳性,非致病性和快速生长的土壤细菌,用于工业氨基酸和维生素生产。在旋转振荡器(300rpm)的30℃下补充有不同合适的硫源的改性最小培养基E(mmes)预制细胞,测量这些培养物的600nm处的光密度。使用微板Cellstar,96孔悬浮培养板(GreinerbiOne)接种这些预培养物用于接种100μl生长培养基(MME + 0.1mm硫源,开始OD 0.01)。为避免蒸发和冷凝,在孵育和测量期间将板用透明,疏水和透气性塑料薄膜(呼吸易腐烂)密封。


通过使用Nephelostar监测培养物的浊度来记录生长曲线。激光强度调节至50%,激光束焦点焦点为2.5mm。孵育温度为30℃,在测量循环之间,板甘蔗般摇动3mm的甘蔗般摇动。

成绩与讨论

在早期的实验中,光密度方法获得的数据的可比性是通过使用透射阅读器和使用浊度计测量光的散射得到的数据来保证的。对谷氨酰胺培养物进行连续稀释,并通过测量光密度和前向散射光来测定浑浊度。从图2可以看出,两种方法之间具有良好的相关性,在4 OD范围内几乎呈线性关系。

图3显示了比浊法的良好重现性,显示了谷氨酰胺培养物的四条独立生长曲线。在这张图中,每条曲线都用了6次重复来绘制时间曲线,包括这四条生长曲线的平均值。

最后,图4显示了细菌生长调节中肾小序测定的具体生物学应用。它显示C.谷氨酰胺野生型和缺失突变体的生长曲线,其具有用于调节蛋白的缺失基因。两种菌株在补充有不同硫源的最小培养基上培养(S1,S10,S11和S24)。绘制的生长曲线表明,与野生型相比,缺失突变体在S1上变得更好,但在S10上更差,并且在S24上不再进一步。

结论

所述的应用表明,激光比浊法是一种可靠的监测微生物生长的技术,除了经典的应用如复合溶解度测试和免疫沉淀。研究表明,浊度法与浊度法相比,不仅具有可比性,而且在灵敏度方面明显优于浊度法。浊度法的关键优点是能够检测散射光,即使散射粒子的浓度很低,这是在滞后阶段和开始阶段的情况下。使用NEPHELOstar而不是传统的传输读者,而是可以更准确地监测生长曲线的早期部分。

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