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监测受体配体在活细胞中的结合

Dominik Schelshorn (1) Franka Maurer (2) (1)Geneva Biotech(2)BMG德赢vwin官网客服 Labtech 07/2015
  • 营地BRET生物传感器系统应用于活细胞
  • 克拉罗星的高灵敏度LVF单色仪®微孔板读卡器可以在不使用滤波器的情况下检测BRET发射信号

表的内容

介绍

生物发光共振能量转移(BRET)是研究蛋白质蛋白质相互作用的建立方法。大多数研究侧重于GPCR,因为这些受体在新毒品候选人中发挥着重要作用。1


有几种基于布雷特的方法,可允许监测蛋白质 - 蛋白质相互作用2如:

  • 受体和配体之间的BRET3.
  • 受体和G蛋白之间的布雷
  • 受体和下游效应体之间的BRET,如腺苷酰基环化酶或离子通道
  • 布雷特传感器跟随贝塔-逮捕素招募营布雷特生物传感器

在本申请中,我们将展示CAMP BRET Biosensor如何使用ClarioStar微孔板读取器的连接配体绑定。


测定原理

BRET Biosensor承载CAMP绑定域,Renilla荧光素酶和YFP。后两个紧邻。一旦荧光素酶通过底物加成(Coelentazine H)激发酶发射激发YFP。这导致530nm处的强发射信号,因此在强大的布雷特信号(图1)。一旦配体与GPCR结合,就激活了G蛋白质并且产生阵营。免费营地将使其装订位点,生物传感器将经历一致性变化,导致Rluc和YFP之间的距离更远。该过程的结果是否或仅弱的YFP发射,导致小型布雷信号。


一旦发现了能够实现构象变化的配体,就可以通过剂量反应来确定EC50.价值观。


材料与方法

  • 来自尼坦的白色96孔微孔板
  • 道尔顿制药服务公司的Coelenterazine h
  • CLARIOstar microplate读卡器来自BMG实验室德赢vwin官网客服

如参考文献2中所述制备营养生物传感器2.用融合质粒瞬时转染细胞。在BRET实验前一天,将细胞接种到96孔微孔板中。


用于配体绑定的CLARIOstar设置

检测方法: 发光,平板模式,顶部读数
视镜设置: Well模式色度选择
单色仪: 只需选择475-30和535-30 nm,带宽可调至100 nm
过滤器: 发射滤光片475-30和535-30 nm
动力学设置: 循环数量:10
周期时间:90秒
测量时间:0.50秒
获得: 两个频道3600

布雷特计算

  • 比值计算:535 nm / 475 nm
  • 4个首测点取平均值(按比例计算)= A0
  • 平均5个最后的测量点(基于比率)= AT
  • 划分在/ a0
  • 使用颜色梯度可以立即看到积极的结果(如图3所示的例子)

结果与讨论

初始布雷特发光扫描
准备了两组对照。其中一种包含了没有配体的生物传感器,因此需要一个高的BRET信号(BRET最大控制)。第二个良好组成的营养生物传感器伴有高配体浓度。它是一种选择的配体,已知导致CAMP水平的增加,因此变为构象变化。对于后者,预期最小的布雷特信号(BRET控制)。覆盖的发光光谱如图2所示。2。

配体与受体的结合
可以在一个微孔板上测试不同的配体。在MARS数据分析软件中应用颜色梯度,以快速概述配体有效结合的孔(图3)。

只有经过forskolin处理的样品BRET比率下降。Forskolin可以直接激活腺苷酸环化酶,进而产生cAMP。因此,forskolin可以作为本实验的对照品。通过在重复井中加入不同数量的forskolin,创建了剂量响应曲线(图4)。

虽然内在测定窗是非常小的,但Clariostar足够敏感,以便通过使用BRET特定发射滤波器或使用LVF单色器来检测小的发光变化。重复的标准偏差足够小,以获得具有R的优秀的4参数剂量响应曲线2> 0.999。


结论

ClarioStar酶标读者是一种合适的仪器,用于在CAMP BRET Biosensor技术的帮助下检测蛋白质配体绑定。MARS数据分析软件可以设置为使用颜色梯度来快速识别导致受体构象变化的配体。


参考文献

1) Kocan和Pfleger (2011) BRET对gpcr -蛋白相互作用的研究。方法:分子生物学746:357-371。
2)Salahpour等。(2012)BRET生物传感器,用于研究GPCR生物学,药理学和信号转导。前端内分泌。(洛桑)3:第105条。
3) Stoddart et al.(2015)应用BRET监测配体与GPCRs的结合。Nat方法12(7):661-663。

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