苔藓细胞作为生物制药的表达系统

用自体荧光法测定活细胞总数
Clariostar.^®LVF单色器^TM值测量GFP和叶绿素的发射扫描
可以检测到每孔下降到500个细胞的苔藓细胞

介绍

苔藓Physcomitrella patens.是植物生物学中的模型生物体。快速再现循环，同源重组的高速率和单倍体原型细胞的EF展合法的可用性使得苔藓高兴地作为重组蛋白的表达系统。作为一种真核生物，苔藓遗留了所有重要的翻译后修饰功能，用于生产生物功能性分量，使其成为例如优越的选择。细菌生产系统。

在本申请中，我们将通过使用来自叶绿素的流动荧光表示的自动流荧光来展示如何确定每孔的个体化活性苔藓细胞总数，并将其与新转化的GFP表达细胞的相对数量进行比较。通过BMG Labtech的Clariostar微孔板读卡器进行了所有流荧光扫描和强度测量。德赢vwin官网客服

材料与方法

在生物反应器培养出苔藓原生质体后，将细胞转化为携带GFP基因作为荧光报告基因的载体，并靶向细胞核。未转化的原生质体作为对照。对这些细胞进行一系列稀释，最终理论浓度从225000个细胞/孔降至110个细胞/孔。所有稀释液在底部透明孔的黑色孔板中重复制备。只填充培养基的井作为空白对照。为了进行自发荧光和绿色荧光蛋白的测量，CLARIOstar采用了以下仪器程序:

检测模式：	荧光强度
方法：	底光学器件使用
扫描模式：	平均轨道
扫描直径：	3毫米
每孔闪光数量：	8

自动荧光的光学设置
LVF单色仪：475-30 / 680-20

WTGFP测量的视镜设置
LVF单色仪：385-12 / 510-20

成绩与讨论

使用叶绿素自动流度和GFP测定转化的苔藓细胞的相对数量
实验的目的是确定在荧光阅读器中测量gfp表达细胞的最低必要数量。将来，通过在测量过程中使用一定数量的苔藓细胞，重组蛋白在不同苔藓菌株中的相对表达率可以比较。一种计算存在于微孔板孔中的活细胞总数的简单方法是利用苔藓细胞的自身荧光。苔藓细胞含有叶绿素a和b。这些色素的远红色发射可作为细胞计数的工具。

图。图1显示了未转化的苔藓细胞的发射扫描以及表达GFP的苔藓细胞。

Clariostar发射扫描 — 图1：克拉克罗斯特发射扫描在450和740nm之间，而激发波长设定为395nm。模拟控制苔细胞由红色曲线表示。绿色曲线可以跟随表达苔藓细胞的GFP的发射。

两种苔藓细胞均在684 nm左右有一个明显的叶绿素荧光峰。野生型GFP在510nm左右的发射只有在表达GFP的细胞中才能发现。通过激发和发射扫描，确定了最佳的LVF单色器叶绿素波长:激发475-30和发射680-20。

通过测量，可以计算出叶绿素自荧光与苔藓细胞理论数量的关系的标准曲线(图2)。

图2：用越来越多的苔藓细胞的样品中的Clariostar测量自动流荧光的荧光强度值。绿色曲线显示GFP表达细胞的稀释，而红色曲线表示不表达GFP的连续稀释细胞。

两条曲线非常相似，表明自动流荧光是确定可行细胞总数的有用工具。从标准曲线来看，我们得出结论，苔藓细胞的自动流荧光的检测极限是每孔约500个细胞。

扫描GFP表达细胞和模拟控制的扫描比较
原生质体在井中的分布可能不均匀。为了研究这一假设，使用表达gfp的苔藓细胞、非转化细胞和中等浓度对照样品进行了井扫描。

Clariostar扫描GFP表达的苔藓细胞 — 图3：Clariostar井的GFP表达苔藓细胞（线A），模拟控制（D）和媒体仅控制（井F1）。激发波长385-12nm，发射波长510-20nm。

结果（图3）清楚地表明苔藓细胞确实不会在井中均匀分布。一些井显示聚集体，这会对井中的中间测量结果的可靠性产生负面影响。因此，建议使用轨道平均函数。在这种模式下，测量在井中的轨道上进行轨道，在井中具有透明直径。将显示所有轨道测量点的平均值。轨道平均功能的使用将导致更稳定的值随着复制孔的偏差而降低。

在图3中。图3显示了与模拟控制相比，表达苔藓细胞的GFP显示出更高的荧光值。然而，对照也显示出越来越多的细胞流动倒数的增加。因此，可以得出结论，叶绿素也通过385nm的激发波长激发，并且背景减法需要非转化的控制。在该实验中，GFP构建体变成苔藓细胞的转染率似乎约为20％。较高的转染率将导致更好地辨别GFP表达的苔藓细胞和模拟控制，因此在测量所需的细胞中的较低总数中。