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使用氟星Omega对原发性人类巨噬细胞中炎性细胞因子的多重分析

Brenda E. Mutch Kate Willetts Emma Timms Brian MJ Foxwell 肯尼迪风湿病学院 12/2008
  • 测定不同炎症因子的蛋白浓度
  • 从96口井降至384口井,灵敏度没有下降
  • FLUOstar®Omega用于测量ELISA和荧光素酶测定

表的内容

介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征是慢性炎症和关节中免疫活性细胞的积累。在关节中聚集的细胞包括巨噬细胞和T细胞,这些细胞产生炎症介质,特别是驱动炎症过程的肿瘤坏死因子(TNF)。这些细胞也表现出增加而不足的抗炎细胞因子的产生,包括IL-10。


本实验室和其他机构最近的研究表明,在人类和动物的RA模型中,TLR (Toll样受体)家族在驱动RA细胞因子的产生中具有潜在的作用。


tlr是识别“病原体相关分子模式(PAMPs)”的受体,如与细菌、病毒或真菌感染相关的脂多糖(LPS)或dsRNA。筛选潜在新靶点的限制一直是足够的组织/原代人类细胞的可用性。通过减少试验所需的细胞数量,就有可能在每个供体上测试更多的目标和多个输出。在本应用笔记中,我们展示了不同的检测方法来监测BMG实验室的氟星Omega上的细胞因子活性。德赢vwin官网客服通过减少单元格的数量,我们将格式从96孔缩小到384孔。


荧光Omega是一种多功能,自动微孔板阅读器,提供一系列的检测模式:紫外/可见吸收光谱,荧光强度,时间分辨荧光,时间分辨荧光,发光(闪光和辉光)和AlphaScreen®

材料与方法

  • 人TNF-a和IL-6的捕获和检测抗体购自BD Pharmingen
  • 巨噬细胞殖民地刺激因子(M-CSF)购自PEPROTECH
  • LPS是从Alexa那里购买的
  • 96孔清晰的组织培养板
  • 384井清澈的组织培养板,Appleton树林
  • 96孔和384孔荧光素酶实验板,带固体条带
  • 96孔和384孔ELISA板,Appleton Woods
  • 星欧米茄,BMG实验室德赢vwin官网客服

细胞和细胞培养
使用Ficoll-Hypaque (Nycomed)从单个供者单位血液的褐皮中制备pbmc(外周血单个核细胞)。如前所述,通过离心淘析(>85%纯度)分离单核细胞,常规收集并在含有10%热灭活胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中培养。在100 ng/mL M-CSF (Peprotech)作用下,单核细胞分化3天。冲洗掉非贴壁细胞,使用细胞离解培养基(Sigma)去除剩余的贴壁细胞,计数并在化验前重新电镀。96孔板的生长面积是384孔板的5倍,因此细胞数量和介质体积都以同样的比例减少。加10 ng/mL刺激细胞E.coli.有限合伙人(Alexa)派生而来。所有细胞培养孵育均在37°C含5% CO的湿气氛中进行2

腺病毒载体和细胞感染的产生
使用如先前描述的Adeasy系统制备重组,复制缺陷的腺病毒构建体。MCSF衍生的巨噬细胞在1×10的96孔板中镀层5细胞/孔,2x104细胞/孔在384孔板,并允许表达腺病毒转基因至少24小时。使用的腺病毒是NFκB荧光素酶腺病毒(AdNFκB-luc),它包含四个串联的位于萤火虫荧光素酶基因上游的κ增强因子拷贝。该腺病毒由P.B. McCray Jr.(爱荷华大学,爱荷华市,IA)提供,是pNFκB报告载体(BD Clontech)的修饰。

ELISA
巨噬细胞在1 × 10的时间被电镀5细胞/孔在96孔板中,在2×10处4在384孔板中的细胞/孔,在37℃下孵育24小时,并用10ng / ml LPS刺激。18小时后收获上清液,并在制造商的说明后检查浓度TNF-A和IL-6。在450nm上读取吸光度在FluoStarωωω,并使用MARS数据分析软件进行分析。结果呈现为三份培养物的平均浓度±SD。


荧光素酶报告总基因测定
用一定范围的Moi(感染的多样性,即病毒颗粒/细胞的数量)感染细胞,以生成GFP表达和荧光素酶单位的标准曲线。LPS刺激后,PBS冲洗1次,用100 μL(96孔)或50 μL(384孔)CAT裂解液裂解细胞。细胞裂解液(50 μL 96孔或25 μL 384孔)转移到光度计试管中,(120 μL 96孔或60 μL)荧光素酶检测缓冲液和30 μL荧光素,如上所述添加。荧光素酶活性的测定是通过荧光相对发光单位(RLU)检测,使用的是fluosstar Omega reader和MARS数据分析软件。

结果与讨论

在用LPS巨噬细胞刺激后,在96孔和384孔格式中获得的TNF-A的浓度是可比的,只要细胞和培养体积的比率保持恒定到孔的生长面积(图1)。

96孔板和384孔板之间的IL-6浓度也具有可比性(图2)。

用于量化IL-10和IP-10等其他细胞因子的ELISA测量也成功地在384孔板中成功进行。结果符合96孔格式(数据未显示的数据)获得的值。在荧光素酶测定的帮助下检测活性细胞因子NFκB(图3)。

当使用少于25个病毒敏感性时,使测定不可靠。


如图4所示的96孔和384孔结果在其信号高度不相当,因为384孔板在2.5倍以下的裂解缓冲液中裂解,因此相对荧光素酶单位比使用96孔板获得的相对荧光素酶单位约为2.5倍。将更多裂解缓冲液加入到384孔板中,以确保足够的裂解物进行荧光素酶测定。


结论

当使用所述分组特征时,所述氟星Omega平板阅读器具有分析同一试验平板上的多种细胞因子的潜力。这项初步研究表明,人原发性巨噬细胞可以在384孔板中培养,而不改变形态学或细胞因子表达。


在不改变敏感性的情况下减少每次试验所需的细胞数量,将为对原细胞进行筛选试验提供可能,以寻找自身免疫性疾病的新靶点。以前,这只可能发生在不像原代细胞那样对TLR配体做出反应的细胞系中。在384孔板上成功的腺病毒感染原发性人巨噬细胞也可以进行报告基因分析。

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