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用FLUOSTAR OMEGA对原发性巨噬细胞炎症细胞因子的多重分析

Brenda E. Mutch Kate Willetts Emma Timms Brian MJ Foxwell 肯尼迪风湿病学院 12/2008
  • 确定不同炎症细胞因子的蛋白质浓度
  • 从96-post缩小到384-井不失敏感
  • flyostar.®Omega用于测量ELISA和荧光素酶测定

介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征在于慢性炎症和关节中免疫伴随细胞的积累。积聚在关节中的细胞包括巨噬细胞和T细胞,这些细胞产生炎症介质,特别是肿瘤坏死因子(TNF),其驱动炎症过程。这些细胞还显示出增加的抗炎细胞因子的增加而不足,包括IL-10。


该实验室和其他研究人员最近在人类和动物类风湿性关节炎模型中显示TLR (Toll样受体)家族在驱动类风湿性关节炎细胞因子的产生中有潜在作用。


TLRS是识别与细菌,病毒或真菌感染相关的脂多糖(LPS)或DSRNA等病原体相关分子模式(PAMP)'或DSRNA的受体。筛选潜在新靶标的限制一直是足够的组织/原发性人体细胞的可用性。通过减少测定中所需的细胞数量,可以在每个供体上测试更多的目标和多个输出。在本申请中,我们显示不同的测定以监测BMG Labtech的Fluostar Omega上细胞因子活动。德赢vwin官网客服通过减少从96井下缩小到384孔格式的细胞数。


Flyostar Omega是一种多功能的自动微孔板读卡器,提供一系列检测模式:UV / VIS吸光度光谱,荧光强度,时间分辨荧光,时间分辨的褶皱,发光(闪光和发光)和alphascreen®

材料与方法

  • 用于人TNF-A和IL-6的捕获和检测抗体从BD Pharmingen购买
  • 巨噬细胞殖民地刺激因子(M-CSF)购自PEPROTECH
  • LPS是从Alexa购买的
  • 96孔清晰的组织培养板
  • 384井清澈的组织培养板,Appleton树林
  • 96孔和384孔荧光素酶测定配有固体条带
  • 96孔和384孔ELISA板,Appleton Woods
  • 氟星欧米茄,BMG LABTEC德赢vwin官网客服H

细胞和细胞培养
使用Ficoll-Hypaque (Nycomed)从单个供者的一个单位的血液的淡黄色被膜部分制备外周血单个核细胞(pbmc)。单核细胞通过离心洗脱(>85%纯度)分离,常规收集并在含有10%热灭活胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中培养,如前所述。在100 ng/mL的M-CSF (Peprotech)作用下,单核细胞分化3天。洗去非贴壁细胞,使用细胞分离介质(Sigma)去除残留的贴壁细胞,计数并在实验前重新镀。96孔板的生长面积是384孔板的5倍,因此细胞数量和介质体积按相同的比例减少。加入10ng /mL刺激细胞E.coli.有限合伙人(Alexa)派生而来。所有的细胞培养都在37°C,含5% CO的潮湿气氛中进行2

腺病毒载体和细胞感染的产生
使用如先前描述的Adeasy系统制备重组,复制缺陷的腺病毒构建体。MCSF衍生的巨噬细胞在1×10的96孔板中镀层5细胞/孔,2x104细胞/孔在384孔板中,使其表达腺病毒转基因至少24小时。使用的腺病毒是NFκB荧光素酶腺病毒(ADNFκB-LUC),含有位于萤火虫荧光素酶基因上游的κ增强子元素的四个串联拷贝。这种腺病毒由P.B.提供McCray Jr.(爱荷华州爱荷华大学IA大学),是PNFκB记者向量(BD Clontech)的修改。

埃莉莎
巨噬细胞在1x10时被镀5细胞/孔在96孔板中,在2×10处4在384孔板中的细胞/孔,在37℃下孵育24小时,并用10ng / ml LPS刺激。18小时后收获上清液,并在制造商的说明后检查浓度TNF-A和IL-6。在450nm上读取吸光度在FluoStarωωω,并使用MARS数据分析软件进行分析。结果呈现为三份培养物的平均浓度±SD。


荧光素酶报告总基因测定
将细胞感染了一系列MOI(多重感染I.E.病毒颗粒/细胞),以产生用于GFP表达和荧光素酶单位的标准曲线。在LPS刺激后,将细胞在PBS中洗涤一次并用100μl(96孔)或50μl(384孔)猫裂解缓冲液裂解。将细胞裂解物(50μl96-孔或25μl384-孔)转移到发光计比蛋白条带中,并如前所述加入30μlLuciferin的荧光素酶测定缓冲液和30μl荧光素。通过使用FluoStar Omega读取器和MARS数据分析软件检测相对发光单元(RLU)中的发光来测量荧光素酶活性。

成绩与讨论

在用LPS巨噬细胞刺激后,在96孔和384孔格式中获得的TNF-A的浓度是可比的,只要细胞和培养体积的比率保持恒定到孔的生长面积(图1)。

96孔板和384孔板之间IL-6浓度也相当(图2)。

用于量化IL-10和IP-10等其他细胞因子的ELISA测量也成功地在384孔板中成功进行。结果符合96孔格式(数据未显示的数据)获得的值。在荧光素酶测定的帮助下检测活性细胞因子NFκB(图3)。

当使用少于25个病毒敏感性时,使测定不可靠。


如图4所示的96孔和384孔结果在其信号高度不相当,因为384孔板在2.5倍以下的裂解缓冲液中裂解,因此相对荧光素酶单位比使用96孔板获得的相对荧光素酶单位约为2.5倍。将更多裂解缓冲液加入到384孔板中,以确保足够的裂解物进行荧光素酶测定。


结论

Flyostar Omega读数器允许在使用分组特征时分析同一测定板上的多种细胞因子。该试点研究表明,人工初级巨噬细胞可以在384孔板中培养,而无需任何变化或细胞因子表达。


在不改变敏感性的情况下减少每个测定所需的细胞数目,现在将打开对原发性细胞进行筛查检测以寻找自身免疫性疾病的新靶标的可能性。以前,这只可能在不与原代单元相同的方式响应TLR配体的细胞系中。在384孔板中成功的腺病毒感染原发性巨噬细胞也允许进行报告分析。

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