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纳米高通量筛选(NHTS)平台 - 基于细胞的GPCR和激酶测定的小型化

EJ戴尔(1)Sunitha Sastry(2)Bonnie Edwards(3)景王(3) (1) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH (2) DiscoverX (3) Labcyte Inc 12/2012
  • 基于细胞的,纳米平台可以屏幕略小到250个细胞/孔的体积小于一个微升
  • 路径®使用回波555液体分配器分配GPCR和激酶细胞系
  • Pherastar.®FS用于1536孔和3456孔微孔板的信号检测

表的内容

介绍

随着更敏感的技术的发展,对高通量筛选的基于细胞的测定的进一步小型化现在是非常可行的。在亚微升体积中进行基于细胞的测定,转化为非常低的复合要求和更少使用的细胞。除了更经济的外,还可以在相同的时间和相同的整体价格中进行更多的实验。


结合三个公司的技术,开发了NHTS平台,以在1536和3456孔板中以基于电池的测定格式筛选GPCR(这里未显示的数据)。使用的技术包括Discoverx的PathHunter®GPCR Beta- Arternin和PathHunter®细胞激酶检测平台;Labcyte的回声®液体处理系统转移细胞和化合物;以及BM德赢vwin官网客服G LABTECH的pherstarFS微孔板读卡器用于低体积检测。


测定原理

途径®DiscoverX的技术是对EFC的一种适应,它提供了一种新的基于细胞的检测格式,用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。在这种方法中,ProLink™被添加到GPCR (1B)或RTK或细胞因子受体(1C)中,而EA以β-Arrestin融合蛋白(图1B)或SH2磷酸酪氨酸结构域(图1C)的形式重组表达。配体结合时受体的激活允许GPCR-β-Arrestin或RTK-SH2蛋白相互作用,从而产生可测量的化学发光信号。

材料与方法

  • Pherastar.FS来自BMG德赢vwin官网客服 Labtech.
  • 回声®来自Labcyte PathHunter的555液体处理器®来自Discovrx的细胞系和测定试剂
  • 1536-和3456-孔隙来自极光的微孔板

细胞处理
路径®将细胞稀释在汉克的缓冲盐水中。加入40μl以回声®384孔聚丙烯微孔板(P-05525)合格。路径®使用回声将细胞转移到Aurora 1536-孔或3456孔微孔板中®555液体处理器与384PP_AQ_SP校准。作为测试计划的一部分,细胞体积是不同的。用DMSO稀释培高利特、催乳素或β-NGF等化合物,然后加入Echo中®合格的384孔聚丙烯微孔板,使用384PP_DMSO校准在30 nL下转移。用β-抑制素和细胞培养激酶测定建议。


添加检测试剂
路径®闪光检测试剂从回声转移®合格的384孔微孔板并转移(按细胞体积1:1比例:PathHunter)®闪光检测试剂)与回声®555液体处理器384pp_aq_sp校准。在室温下孵育30mns。


检测
在pherstar上测量了1536井和3456井的微孔板FS使用发光光学模块,使用0.1秒/孔/孔的测量时间为3600。在读取板之前,在良好的良好中进行自动Z高度调节。0.1 mm可调Z高度允许PherastarFS在所有细胞分析中获得尽可能高的信噪比。

结果与讨论

附着的格式
路径®将1000个细胞/孔表达Trk A和PRLR-JAK1的U2OS细胞接种于白色TC包被的AURORA 1536培养皿中,用已知的激动剂β-NGF和催乳素刺激。这些板在22°C下培养3小时。在总体积为6 μL时,检测出了稳健的检测反应(图2)。

路径®表达多巴胺受体长亚型D2的CHO-K1细胞,在1000个细胞/孔中接种于涂有TC的AURORA 1536白色培养皿中,孵育过夜使细胞粘附。在37℃下用培高利特刺激细胞90分钟(图3)。

这些结果表明了路径®arrestin(和激酶)检测方法可以成功地适应于使用贴壁细胞在1536孔微量滴度板上的检测。

使用Echo进行细胞播种的协议®555应用于电池分配到3456孔板中,图5测试了不同细胞密度的性能,以确定新的板格式的最佳细胞数。路径®DRD2L细胞100或250细胞/孔(悬浮)通过Echo以0.5或1 μL体积加入AURORA 3456孔板®仪器。通过回声将化合物(DMSO中的5倍的100x含量为100倍)加入到0.5μl(10ng的10ng)中的细胞中加入®仪器。


结论

具有高度发展的自动化技术的小型化提供了更快的屏幕的较低成本。在这里,我们已经证明了使用Labcyte的Echo Liquid Handler和BMG Labtech的Pherastar在3456和1536平台中应用了Discovex的PathHunter GPCR和细胞基激酶测定德赢vwin官网客服FS。我们描述了一种以nts细胞为基础的筛查平台,可以在每孔使用少于1微升的250个细胞来测量。

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