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使用ClarioStar和Pherastar FS监测LigAnd与活细胞中GPCR的配体的纳米ret测定

Leigh A Stoddart (1) Elizabeth KM Johnstone (2, 3) Amanda J whal (1) Jo’le Goulding (1) Matthew B robbers (4) Thomas Machleidt (4) Giovanni Abbenante (5) Keith V Wood (4) Stephen J Hill (1-3) Kevin DG Pfleger (2,3) (1)诺丁汉大学医学院生命科学院(2)Harry Perkins医学研究所(3)西澳大利亚大学医学研究中心(4)Promega Corp.(5)BMG Labtech德赢vwin官网客服 09/2015
  • 首先使用BRET用于监测LigAnd与Nanoluc启用的活细胞中的GPCR结合®荧光素酶
  • 集成电路50.和K.D.数值由饱和和竞争结合分析计算

表的内容

介绍

由于G蛋白偶联受体(GPCRs)在介导细胞对外界刺激的反应中发挥着至关重要的作用,这些受体在未来许多年里一直是并将继续是医学研究和制药工业的主要焦点。它们的重要性尤其突出,有统计数据表明,30-50%的已销售药物针对的是GPCRs。


目前研究配体与GPCRs结合的分析技术包括放射性、荧光配体和荧光共振能量转移(FRET)。BRET(生物发光共振能量转移)1只需要添加合适的衬底来产生施主光发射,以及以非辐射方式激发荧光标记配体的能量。在适当的转染细胞系中,供体荧光素酶可以在感兴趣的受体的n端表达。理论上,BRET应该比基于fret的检测方法更敏感,然而,寻找适合于这种n端融合的荧光素酶的实际困难阻碍了用于配体结合研究的BRET检测方法的发展。

最近,Promega的研究人员开发了一种名为NanoLuc的基因工程荧光素酶®(Nluc)来自从深海虾分离的天然荧光素酶。2Nluc分子量相对较小(19kDa),非常稳定(高达55°C)。与其他荧光素酶- gpcr融合构造不同,它很容易在GPCRs的n端表达,并有效地运输到细胞膜上。3.


测定原理

在这个特殊的例子中,GPCR在n端有Nluc荧光素酶的活细胞中表达。3.该受体的配体然后用荧光团标记,荧光团的激发光谱与Nluc的发射光谱重叠。配体被引入活细胞,然后加入Nluc底物(furmazine)。如果配体不与受体结合,则只检测到Nluc的蓝色发射。如果配体与受体特异性结合,通过Nluc的共振能量转移激发其荧光标记,也会检测到红色荧光。未标记配体的竞争性结合会导致这种红色荧光的浓度依赖性下降(图1)。


材料与方法

在STODDART等人的在线方法中提供了详细的材料和方法。3.


稳定的细胞系生成:HEK293细胞系快递ß2肾上腺素能受体(ß2来自Promega。

荧光标记配体:Promega合成阿普洛洛尔- tamra;普萘洛尔- by630从CellAura获得;阿普洛尔由Sigma获得;从Tocris中获得异丙肾上腺素、普萘洛尔、ICI 118551和CGP 12177。

Nluc和Rluc8发射光谱:转染后24小时,细胞表达Nluc-ß2基于“增大化现实”技术或Rluc8——ß2在37℃的优选中在37℃下在96孔板中孵育180分钟,在没有酚红色(Gibco)。然后将荧光素酶亚呋喃嗪(Nluc)或Coelenterazine H(Rluc8)以10μm的浓度加入到孔中。

BRETß.2Ar-ligand结合测定:用Nluc-ß转染HEK293细胞2在96孔板中评估了AR。对于使用Alpronolol-Tamra的饱和结合实验,在不存在或存在的情况下,将连续稀释的alpronolol-Tamra加入到孔中,在室温下将板温育120分钟。然后将富嗪基质加入到10μm的终浓度。在室温下测量BRET。对于竞争结合实验,Nluc-β2稳定转染AR的HEK293细胞与10 nM的普萘洛尔- by630孵育,所需浓度的竞争配体在heps缓冲盐水溶液中稀释,37°C 1小时。


仪器的设置
Nluc和Rluc8发射光谱:用Clariostar测定发射光谱®平板阅读器采用了单色仪的发光扫描选项(20nm带宽;1微米的分辨率;积分时间:500 ms;获得:3000)。


BRETß.2AR配体结合测定:
对于使用alprenolol-TAMRA的饱和结合实验,使用端点模式下的CLARIOstar平板阅读器,使用发射滤波器450±40 nm (80 nm带通)和>610 nm (longpass)。在室温下(积分时间:500 ms;增益:两通道3000)。

Pherastar.®FS用于普萘洛尔- by630的竞争结合实验和饱和结合实验;端点模式,NanoBRETTM值模块(460 nm (80 nm带通)和>610 nm (longpass))。在室温下(积分时间1000 ms;460纳米增益,2800;>610 nm增益,3000)。


通过将460nm发射划分> 610-nm发射来计算原始布纹比。使用术语“原始布雷特比”,因为没有减去背景比。


结果与讨论

在最初的实验中,几组HEK293细胞表达ß2发现与Rluc8或Nluc的N-终末标记的均均发现在添加各自的基材上产生发光信号。Nluc信号最大值为460nm,与Rluc8相比480nm(图2)。然而,与RLUC8相比,Nluc的相对信号强度约为70倍(见Stoddart等人的数据。3.)。

尽管Nluc的发射光谱具有460nm的最大值,但它具有明显的强度至约600nm(图2)。这允许在激动剂/拮抗剂GPCR结合伴侣上使用一系列荧光标记。对于表达Nluc-β的HEK293细胞2基于“增大化现实”技术,ß2AR拮抗剂alpronolol用Tamra标记(Ex 565,EM 580)。

观察到特异性配体结合,与未标记的阿普洛尔(10 μM)竞争可完全阻止这种结合(图3)。


然后评估第二荧光配体,普萘洛醇-YP630。从饱和结合实验与该标记的拮抗剂与受体结合,平衡结合常数(kD.)为18.9±4.1 nM。


最重要的是,通过增加未标记的β的浓度,可以减少从普萘洛醇-YP630与受体的相互作用产生的布纹信号。2AR拮抗剂普萘洛尔,ICI 118551和CGP 12177和激动剂异戊二烯(图4)。从这些实验来看,PKI值可以从IC计算50.三种拮抗剂普萘洛尔,ICI 118551和CGP 12177(分别为8.13±0.05,8.04±0.04和8.32±0.03)。3.此外,这些值与通过放射性配体结合实验发表的结果相似,4.强调该检测方法对药物发现和分析的适用性。

结论

以上研究牢固地建立了纳米级TM值作为一种可行的替代现有的方法来测定配体结合GPCRs。该方法对基础研究和制药工业都有一定的应用价值。


参考文献

1.方法3,165-174(2006)。
2.霍尔议员等。ACS化学。生物学7,1848-1857(2012)。
3.斯托达特等人。Nat. Methods 12, 661-663(2015)。
4.贝克,j。Br。《药理学杂志》144,317 - 322(2005)。


1英国诺丁汉大学医学院生命科学学院细胞信号研究组。
2分子内分泌学和药理学,哈里帕金斯医学研究所,尼德兰,西澳大利亚,澳大利亚。
3.医学研究中心,西澳大利亚大学,克劳利,西澳大利亚,澳大利亚。
4.Promega Corporation,Madison,Wisconsin,美国。
5.德赢vwin官网客服BMG LABTECH Pty Ltd,莫宁顿,维多利亚,澳大利亚。


NanoLuc是Promega Corporation的注册商标,NanoBRET是Promega Corporation的商标名称。

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