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NanobRet™测定定量评估VEGF与VEGFR2的VEGFR2在活细胞中

kilpatrick le(1)弗里曼-ohana r(2)alcobia dc(1)富有K(2)桃CJ(1)击打AJ(1)Briddon SJ(1)robers Mb(2)Zimmerman K(2)Machleidt T(2)Wood KV(2)羊毛J(1)山SJ(1) (1)诺丁汉大学的生理学,药理学和神经科学部门(2)Promega Corporation,Madison,Wi,USA 01/2018
  • 新的标记技术荧光标记VEGF用于纳米obret相互作用研究
  • Assay获得配体-受体相互作用的定量信息
  • PHERAstar®同时检测荧光素酶和荧光团信号加速和动力学读取

表的内容

介绍

血管内皮生长因子(VEGF)是一种作为二聚体的蛋白质,通过与细胞受体(VEGFR)结合来介导血管生成。配体结合VEGFRs二聚并通过其细胞内酪氨酸激酶结构域启动一系列信号级联。vegf及其受体参与肿瘤血管化,是抗癌治疗的主要靶点。


为了表征与VEGFR2结合的VEGF同种型的AFFI,需要定量和动力学报告这些相互作用的测定。


一种新的标记技术化学计量标记VEGF家族成员VEGF165a用fl uorophore tmr。修饰的配体与在细胞纳米级测定中结合纳米琥珀酶偶联的VEGFR2(NLUC VEGFR2)。

测定原理

VEGF165A被表达为卤素融合蛋白,在分泌后捕获Halolink树脂。通过Halotev和6-TMR-PEG-CBT的存在蛋白水解地除去标签,导致用TMR标记的配体,在单个N-末端半胱氨酸(图1A)

VEGF的结合165使用BRET检测A-TMR同源体对NLUC融合VEGFR2。Brie Fl Y,Nluc谱系呋喃嗪的氧化产生能量,如果两种蛋白质在近距离(<10nm)中,则可以从生物发光供体(Nluc)转移到受体流动泌尿细胞(TMR)。因此,Fl uorophore与荧光素酶发射的比例表明了与其同源受体的流荧光配体的相互作用(图1B)。


材料与方法

  • 白色平底微孔板(Greiner Bio-One #655098)
  • pherastar®.FS.
  • 福永(N1130, Promega Corporation)
  • HEK293稳定表达NLuc-VEGFR2

实验程序
在实验前24小时将表达NLUC-VEGFR2(40,000 /孔)的HEK293细胞。在HBSS / 0.1%蛋白酶的游离BSA中进行测量,富硫嗪浓度为10μm。荧光标记的VEGF.165咯,无标号的VEGF165a和Cediranib(一种RTK抑制剂,1µM)在指定浓度下使用,使用PHERAstar进行测量FS.microplate阅读器使用下面概述的设置。


仪器设置

光学设置 发光,端点或平板模式动力学,顶部光学
光学模块 nanobret;
EM 1 460-80(Nluc)
em2 LP610 (TMR)
获得 2800(Nluc)
3600(TMR)
一般设置 沉淀时间 0.0秒
测量间隔 1秒钟
动态设置 数量的周期 33
周期时间 30年代
孵化 端点 没有一个
动力学 37°C

结果与讨论

TMR-labelled VEGF的165将浓度为1-20 nM的a加入到表达HEK293细胞的NLuc-VEGFR2中,用nanoobret监测配体-受体的相互作用。图2所示的BRET比值的时间过程显示,在反应开始10分钟后,结合增加,结合达到平衡。

接下来,通过VEGF的位移来测试测定法测定配体结合AFFI的能力165a-TMR通过未标记的竞争VEGF与VEGFR2结合165a. VEGF之间的相互作用165a-TMR和VEGFR2因BRET信号丢失引起的竞争异构体浓度增加而受损(图3)。VEGF的pKi165BRET确定的是9.81。

受体酪氨酸激酶抑制剂Cediranib对VEGF的影响165监测a- tmr与VEGFR2的结合2小时。在没有抑制剂的情况下,配体与VEGFR2结合,在加入配体大约15分钟后获得BRET信号峰值(图4,空符号)。在随后的时间点,BRET信号由于受体内化和随后的复杂解离而降低。相比之下,在cediranib存在下,观察到高BRET比率,并在实验期间(2hr)保持。这是由于cediranib阻止了VEGFR2内化,这后来被共焦和超分辨率成像证实(Kilpatrick等人,2017年(1),图7a;本报告未包含的数据)。

结论

单位标记配体的新型方法用Fl uorophore铺平了使用纳米ret来量化抗癌靶VEGFR2的分子药理学的方法。Pherastar微孔板读者可靠地检测到产生的发光和流动荧光信号。同时采集两个信号加速了板的读数并增加了时间分辨率。最新的测定和检测技术的组合有助于更好地理解和靶向癌症相关的生物事件。


参考文献

1.Kilpatrick LE et al. (2017) Biochem Pharmacol。7月15日;136:62 - 75。doi: 10.1016 / j.bcp.2017.04.006

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