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NanobRet™测定定量评估VEGF与VEGFR2的VEGFR2在活细胞中

kilpatrick le(1)弗里曼-ohana r(2)alcobia dc(1)富有K(2)桃CJ(1)击打AJ(1)Briddon SJ(1)robers Mb(2)Zimmerman K(2)Machleidt T(2)Wood KV(2)羊毛J(1)山SJ(1) (1)诺丁汉大学的生理学,药理学和神经科学部门(2)Promega Corporation,Madison,Wi,USA 01/2018
  • 新颖的标记技术FLOSECPELLY标记VEGF用于纳米多元互动研究
  • 测定获得有关配体 - 受体相互作用的定量信息
  • Pherastar.®同时检测Luciferase和FL uorophore信号,用于加速和动力学读数

介绍

血管内皮生长因子(VEGF)是通过与其细胞受体(VEGFR)结合而充当凝血生成的二聚体的蛋白质。在配体结合VEGFR时,VEGFRS通过细胞内酪氨酸激酶结构域微二聚化并引发信号传导级联的筏。VEGF及其受体在肿瘤血管中发挥作用,是抗癌疗法的主要目标。


为了表征与VEGFR2结合的VEGF同种型的AFFI,需要定量和动力学报告这些相互作用的测定。


一种新颖的标记技术化为VEGF家族成员VEGF165.a用fl uorophore tmr。修饰的配体与在细胞纳米级测定中结合纳米琥珀酶偶联的VEGFR2(NLUC VEGFR2)。

测定原则

VEGF.165.A被表达为卤素融合蛋白,在分泌后捕获Halolink树脂。通过Halotev和6-TMR-PEG-CBT的存在蛋白水解地除去标签,导致用TMR标记的配体,在单个N-末端半胱氨酸(图1A)

VEGF的结合165.使用BRET检测A-TMR同源体对NLUC融合VEGFR2。Brie Fl Y,Nluc谱系呋喃嗪的氧化产生能量,如果两种蛋白质在近距离(<10nm)中,则可以从生物发光供体(Nluc)转移到受体流动泌尿细胞(TMR)。因此,Fl uorophore与荧光素酶发射的比例表明了与其同源受体的流荧光配体的相互作用(图1B)。


材料与方法

  • 底部微孔板的白色fl(greiner生物-on-one#655098)
  • pherastar®.FS.
  • 呋喃嗪(N1130,Promega Corporation)
  • HEK293稳定表达NLUC-VEGFR2

实验程序
在实验前24小时将表达NLUC-VEGFR2(40,000 /孔)的HEK293细胞。在HBSS / 0.1%蛋白酶的游离BSA中进行测量,富硫嗪浓度为10μm。荧光标记的VEGF.165.-tmr,未标记的VEGF165.A和Cediranib(RTK抑制剂,1μm)用于指定的浓度,并用Pherastar获得测量FS.使用下面概述的设置的微孔板读卡器。


仪器设置

视镜设置 发光,端点或板模式动力学,顶视音
光学模块 nanobret;
EM 1 460-80(Nluc)
EM 2 LP610(TMR)
获得 2800(Nluc)
3600(TMR)
常规设置 建立时间 0.0秒
测量间隔 1秒钟
动力学设置 周期数 33.
周期 30秒
孵化 终点 没有任何
动力学 37℃

成绩与讨论

TMR标记的VEGF165.将A以1-20nm的浓度加入到表达HEK293细胞的Nluc-VEGFR2,以监测纳米多元的配体受体相互作用。如图2所示所示的布雷特比的时间过程显示在反应开始后10分钟的结合和平衡的增加。

接下来,通过VEGF的位移来测试测定法测定配体结合AFFI的能力165.通过未标记的竞争VEGF将A-TMR与VEGFR2结合165.一种。VEGF之间的相互作用165.通过损失BRET信号(图3)报道的竞争同种型浓度增加,A-TMR和VEGFR2受到损害(图3)。VEGF的PKI165.BRET确定的是9.81。

受体酪氨酸激酶抑制剂Cediranib对VEGF的影响165.监测与VEGFR2的A-TMR结合2小时。在没有抑制剂的情况下,与VEGFR2结合的配体,在配体加入后约15分钟的峰列标题中结合(图4,空符号)。在稍后的时间点,由于受体内化和随后的复杂解离而减少了布雷特信号。相反,在核苷酸存在下,观察到高标题比,其持续用于实验期(2HR)。这是由于Cediranib防止VEGFR2内化,后来被共焦和超分辨率成像(Kilpatrick等,2017(1),图7A;本报告中未包含的数据)。

结论

单位标记配体的新型方法用Fl uorophore铺平了使用纳米ret来量化抗癌靶VEGFR2的分子药理学的方法。Pherastar微孔板读者可靠地检测到产生的发光和流动荧光信号。同时采集两个信号加速了板的读数并增加了时间分辨率。最新的测定和检测技术的组合有助于更好地理解和靶向癌症相关的生物事件。


参考

1. kilpatrick Le等。(2017)Biochem Pharmacol。7月15日;136:62-75。DOI:10.1016 / J.BCP.2017.04.006

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