神经退行性疾病的研究

4月02日,2020年4月

今天,发达国家的预期寿命远远超过80岁,但预期寿命越长,患神经退行性疾病的可能性就越大,如阿尔茨海默病、帕金森病和痴呆症。随着这些疾病的发展,他们变得越来越虚弱,直到需要全职护理。不幸的是,这些疾病的病因仍未完全了解,大多数药物只治疗症状。随着预期寿命的增加,我们有必要进一步了解这些疾病并开发新的治疗方法。

安德莉亚·克鲁姆博士的照片
德里亚博士克兰姆博士
博士、应用专家
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生物学测定,包括聚集,细胞毒性和信号传导测定,至关重要,以帮助研究人员了解这些疾病的潜在机制,以及在药物发育早期阶段识别有前途的治疗药。本文详细介绍了这些测定的重要性,需要使用一系列检测方法分析测定的敏感和快速仪器。

什么是神经退行性疾病?

这一术语是指以运动控制缺乏、情绪障碍和认知障碍等症状为典型特征的疾病。顾名思义,这种疾病的特征是神经元的退化。神经元是位于脊髓和脊髓中的不复制的神经细胞。如果神经元受损,则无法恢复,导致大脑功能障碍和不治之症。虽然相似之处神经退化中可以找到相关的疾病,根本原因不同:亨廷顿氏病是由基因突变引起的,根据大量朊病毒引起的疾病是错误折叠的蛋白质(朊病毒)和帕金森症和阿尔茨海默氏症是怀疑是由于遗传和环境因素的组合,通常发生在60岁以上的人。


这些神经退行性疾病的相似之处在于神经元和大脑如何受到损伤。错误折叠的蛋白质发生在所有上述疾病的过程中。它们形成淀粉样原纤维,蛋白质聚集物,形成斑块,并可能损害神经元细胞和脑组织。理解和干扰这种改变是治疗神经退行性变的重要方法,因为它可能使任何疾病的患者受益。

为什么研究神经退行性疾病很重要?

神经退行性疾病仅次于心血管疾病和癌症,是主要死亡原因,与心血管疾病和癌症不同,神经退行性疾病不能治愈或大大减缓。


神经紊乱的症状包括运动障碍、记忆丧失、情绪变化、说话障碍等等。最初,这些功能障碍不会对患者造成重大损害,他们能够继续独立生活。然而,随着这些疾病的发展,患者的生活质量急剧下降,直到他们需要全职护理。因此,在疾病进展期间,社会和经济负担也会增加。


在欧洲,痴呆患者(一种神经退行性疾病的后果)目前每年的护理费用约为1300亿欧元。随着人口老龄化的增加,受影响的人数也在增加。2015年,全世界有4000万人感染了阿尔茨海默病,预计到2030年,这一数字将达到1.3亿,其中有三分之一到一半的85岁以上的人会患上这种疾病。阿尔茨海默病的平均持续时间为2至10年,毫无疑问,到2050年,预计美国每年因该疾病造成的经济损失将达到1万亿美元。


迄今为止,治疗神经退行性疾病的疗法数量有限,其中大多数只能治疗症状。事实上,在过去的五年里,欧洲没有批准任何治疗阿尔茨海默氏症的新药。因此,有效治疗以延缓或减轻这些使人衰弱的疾病的症状,对于限制其对个人、家庭、社会和经济的破坏性影响至关重要。延缓阿尔茨海默氏症的发病仅5年,就能减轻美国50%的经济负担,并且证明即使是有限的延迟也会有好处,提高病人的自主权,减轻家庭和公共健康法案的负担。


确定神经退行性疾病的药物靶点

为了确定治疗神经退行性疾病的潜在新药,了解这种疾病本身是明智的。由于他们广泛而不同的症状和典型的缓慢起病,通常只有在疾病发生时才作出诊断。因此,在了解这些疾病,特别是疾病的诱因和早期阶段方面仍然存在差距。因此,基础研究正在进行中,以更深入地了解这些疾病,并帮助确定新的药物。


在过去10年里,新检测方法的发展使体外高通量研究神经退行性变过程成为可能。这些工具提供了在很短的时间内测试多种实验条件或多种可能药物的可能性。一些关键的检测方法是分析疾病通路和评估潜在药物效果的有价值的工具。接下来,我们将解释聚集性、细胞毒性、信号传导和蛋白质数量的测试,并展示它们如何帮助理解神经退行性疾病。


神经退行性疾病研究中的聚集分析

神经退行性疾病的一个关键特征是可溶的、功能蛋白形成不可溶的、高度有序的蛋白聚集体,称为淀粉样原纤维或斑块。这种转变开始于前纤维物种(二聚体、四聚体、六聚体等)的形成,然后发展成大型的蛋白质聚集复合体。就朊病毒而言,传统上使用全动物模型通过长达6个月的生物测定来监测这些蛋白质聚集物。2012年,蒙大拿州落基山实验室的研究人员开发了一种更快、更高通量的朊病毒播种监测聚合试验,称为实时震动诱导转化试验(RT-QuIC)。

RT-QuIC使用荧光强度来测量朊病毒蛋白的聚集。将荧光染料硫黄素T (ThT)添加到重组蛋白中。分子与纤维形成时形成的β -薄片结合,诱导荧光增加。该方法在微孔板上进行,使用重组朊蛋白、tau蛋白或α -突触核蛋白。间断地摇动板,使其在摇动时发生原纤维的破裂,在静止时形成新的原纤维。这一过程需要168小时,但纤维的形成在更高的温度下加速。因此,蛋白质聚集试验通常在37℃或更高温度下进行。高温、间歇振动和长时间运行的组合,对测量仪器提出了很高的要求。Omega微孔板读卡器系列已被证明是健壮可靠的,可以执行应用说明中概述的繁琐工作。”朊病毒播种的实时震动诱导转化试验“。高温孵育(最多65°C),改进的板载载体和更坚固的运输系统等特征使ω聚集测定的读者。网络研讨会显示了如何优化RT-Quic测量的提示和技巧。

2016年发表的一项研究发现,用脑脊液进行RT-QuiC是对散发的克雅氏病的可靠检测。欧洲、亚洲和澳大利亚的11个中心使用RT-QuiC和BMG LABTECH平板阅读器分析了人类脑脊液样本(有一个例外)。德赢vwin官网客服这些中心对克雅氏病的诊断100%一致(McGuire et al. 2016)。


一种适合于监测聚合开始的方法是采用一种新的荧光团:双(三苯基磷)四苯基乙烯(TPE-TPP)。该染料具有优于ThT染料的特性,因为它更有效地结合。此外,对其荧光偏振(FP)的监测报告了聚合的早期阶段(二聚体、四聚体…)。FP测量溶液中分子的旋转。小分子的运动速度快并使发射去极化,而大分子的运动速度慢并保持发射极化。TPE-TPP与(前)淀粉样结构的结合减慢其旋转,导致FP的可测量变化。该检测方法是由澳大利亚的一个研究小组开发的,他们使用CLARIOstar酶标仪进行FP测量。详细的分析描述可以在应用说明中找到"新型聚集特异性荧光剂利用荧光偏振(FP)监测纤维前蛋白聚集“。

活性测定和毒性测定有助于理解和改善神经元死亡

除了蛋白质聚集,神经元细胞死亡是神经变性的标志。虽然健康成年人的细胞死亡中神经元受到限制,但它们死于神经退行性疾病,导致大脑功能丧失。神经元的死亡通过线粒体或DNA的氧化损伤、蛋白质聚集引起的膜损伤等程序性细胞死亡机制。神经细胞程序性死亡机制为凋亡、坏死和自噬。了解神经元细胞死亡的原因、机制以及如何干预是寻找治疗神经退行性疾病药物的途径。许多实验研究细胞死亡,并帮助解读和调节神经元细胞死亡。我们的博客文章给出了一般细胞毒性试验的概述细胞毒性——这些测试告诉你你的细胞不喜欢什么“。

最常用的细胞毒性测定方法是基于四唑盐的。活性细胞对它们的减少会导致吸光度的变化,这种变化可由酶标仪读取,并表明代谢活动。俄罗斯莫斯科国家医学研究中心的研究人员使用该试验证明,胰岛素限制皮层神经元的兴奋性毒性,这一效应诱导神经元细胞死亡,与神经退行性疾病有关(Krasil 'nikova等人2019年)。


依赖于atp的荧光素酶活性测定因其简单和敏感而广受欢迎。他们通过依赖ATP的荧光素酶来测量裂解细胞的ATP含量。用微孔板读出器测量的光输出与细胞数直接相关。该实验帮助新加坡研究人员揭示了单胺氧化酶(MAO)活性在亨廷顿细胞模型中的细胞毒性作用(Ooi等,2015)。

最近开发的细胞死亡结果不仅报告了一个时间点的毒性报告,而是随时间监测细胞毒性效应。RealTime-Glo™活力测定在活细胞存在下产生光。如果细胞保持在培养环境中(37°C,5%CO2)通过一个大气控制单元来调节阅读器内部的气体,它可以用于连续几天的实时生存能力监测:新克拉罗星大气控制单元(ACU)提供多功能性在长期的细胞为基础的分析。使用在CLARIOstar微孔板阅读器上的检测,研究了特定融合蛋白对神经毒素的保护作用(Paliga等,2019年)。


信号传递试验有助于阐明神经元的功能

神经退行性变的早期事件是神经元信号传导受损。改变的信令过程包括Ca2 +调节突触传递、能量代谢和细胞生存的信号传递或通过受体的信号传递。

加利福尼亚州2 +神经元中的信号传导对于它们作为信息发射器的蜂窝功能至关重要。细胞内Ca.2 +变化可以监测荧光染料,如呋喃-2,氟-8或Cal- 520。申请须知"用荧光染料在中通量测定中监测细胞内钙“比较了不同的测定监测CA2 +。Ca的一个例子2 +帮助神经退行性疾病研究的试验是使用Fura-2来开发一种分化的神经元模型,该模型比其来源的人类神经母细胞瘤细胞更好地反映神经元(Ferguson et al. 2016)。细胞内钙Fura-22 +实验结果表明,KCl对分化的细胞有刺激作用,而未分化的细胞没有增加胞内钙2 +KCL级别。

神经退化生物指标量化

几种蛋白质在不同的神经退行性疾病中表现出表达改变。Tau蛋白与阿尔茨海默病有关,TREM2受体水平与阿尔茨海默病发病风险相关,BDNF生长因子在阿尔茨海默病中降低。帕金森病的神经炎症如IL - 6、IL β1和TNF α水平升高。


定量溶液中特定蛋白的常用方法是ELISA测定。我们的申请须知"快速准确地检测与Simpleestep Elisa的阿尔茨海默病靶标®工具和SPECTROstar®纳米“解释了ELISA原理,并展示了如何用于量化与神经变性相关的蛋白质。基于悉尼/澳大利亚的研究小组使用了TNF-αELISA来研究慢性微胶质活化对炎症标志物的影响。他们发现促炎TNF-α在小鼠模型中升高,慢性微胶质激活,神经退行性疾病的特征(Gyengesi等,2019)。


用于神经退行性变研究的仪器

这些研究证明了高通量方法用于神经退行性疾病的研究。由于需要多种检测模式,多模式平板阅读器被推荐用于神经退行性疾病的研究。


对于聚合分析的性能,分析仪器能够在很长一段时间内震动和孵育微孔板是很重要的,最长可达7天。德赢vwin官网客服BMG Labtech是微孔板领域的技术领导者。多模态平板阅读器包括克拉罗星®+欧米茄系列具有专用板载体,并在长期摇动聚集测量中提供鲁棒性。

有关BMG Labtech Plate Reader如何帮助神德赢vwin官网客服经变性疾病的进一步了解,请参阅我们的专用宣传册“用于神经退行性疾病研究的微孔板阅读器

参考文献

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