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在Clariostar Plus上使用扫描模式,使用Hoechst污染的Hoechst污染的核心数的正常化XFE96代谢分析

伊恩霍尔 癌症研究英国 - 剑桥研究所 09/2020
  • 海主数据的经济实惠的正常化,以考虑使用a的细胞数的差异微孔板读者
  • Clariostar.®使用井扫描读取荧光染色的细胞,以快速和可重复地提供良好的平均水平
  • BMG Labtech软件计算的S / B比率可以粘贴到海德赢vwin官网客服马软件中进行归一化

介绍

Seahorse XFE96分析仪通过监测96孔板中的氧气消耗和细胞外酸化来测量细胞代谢。由于移液误差和不同的生长速率,孔中的细胞数可能因吸扰率和不同的生长率而异。需要归一化以确认孔之间的代谢谱的差异不受细胞数的差异而不是由于实际细胞特征或实验条件而被错误地表明。


德赢vwin官网客服BMG Labtech's Clariostar®微孔板读者测量Hoechst染色细胞的荧光,并准备要进口到海象“Wave”软件中进行标准化的数据。这种归一化方法是基于显微镜的归一化的快速,可靠,并且具有成本效益的替代方案,需要昂贵的仪器。


测定原则

在注射之前将Hoechst染色添加到海象测定的最终试剂中。在测定的最后步骤期间井中的细胞染色。一旦细胞染色,将板从海岸中取出并放入www.v66088.com 。测量井扫描15x15超过3毫米以覆盖海马井(a)。b显示该区域的典型井扫描。BMG Labtech MARS分析软件中计算了空白比率的信号。德赢vwin官网客服自动导出的Excel数据通过简单的“复制和粘贴” - 功能导入海马软件,以可视化归一下数据(C)

材料与方法

  • Seahorse XFE96分析仪
  • Seahorse 96孔板
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech Clariostar.®
  • Tocris Hoechst 33342污渍(猫否5117)

实验程序
对于概念实验证明,将HeLa细胞(滴定在7,500至20,000个细胞中)以16的重复地接种到海象96孔板中。没有细胞的四个角阱用作空白(图2(a))。Hoechst染料(25mm)混合1:1000,在海象分析期间加入到细胞板中的最后一个溶液,以达到每孔2.5μm的最终Hoechst浓度。对于细胞膜测试,溶液C(Rotenone和抗霉素的混合物)补充了Hoechst,因为它是添加到细胞中的最后试剂。在海马运行的最后阶段染色细胞可确保对测定本身没有影响。由于自动染料添加,电池板直接在海马分析后直接被Clariostar读取。每孔15x15点的孔扫描矩阵(图1.(d))被获得以测量整个孔的细胞,并补偿非均匀细胞分布。使用MARS分析软件将平均空白除以平均空白来除以信号/空白比率。然后可以通过简单的“复制和粘贴”功能将此比例导出到Excel中,并导入海马软件。Seahorse软件将将导入的数字应用于分析并自动标准化数据。


仪器设置

视镜设置 荧光强度,终点 - 顶部读取
单色仪设置 Hoechst预设
ex 355-20.
EM455-30
收益和焦点 1400 / 2.1 mm
通用设置 闪光数量 2
建立时间 0秒
扫描 矩阵扫描 15 x15(3mm)
孵化 37℃

成绩与讨论

荧光和微观细胞定量比较
初始实验比较了使用Hoechst和Clariostar的细胞测量使用显微性进行微观细胞计数。两种方法两种在不同密度接种的细胞和每个信号都与每孔20,000个细胞的最大信号有关。绘制对播种细胞数的两种方法的平均值显示出的方法良好的相关性。虽然曲线不是完美的线性,但两条曲线的协议表明细胞定量方法是可比的(图2(b))。

从Clariostar计算到空白比率的信号荧光强度孔的测量孔,没有细胞。通过“复制和粘贴”将数据转移到海象“波”软件。图3中示出了没有归一化和基于Hoechst的归一化的氧气消耗率。要与原始值进行归一化,用最低密度确定为1(图3),计算折叠变化。获得20,000个细胞的非全体化OCRS比7,500个细胞高出3.11倍,而标准化的OCR均为1.77倍。所示结果是用于OCR,但也可以使用该方法实现ECAR上的归一化。

结论

Clariostar.在完成运行后,提供一种简单,快速,快速,经济效益的选项,可以在Seahorse XFE96代谢测定中正常化细胞编号。因此,更换对昂贵的显微镜装置的需求。将Hoechst染料简单地添加到海象测定的最终试剂中标记通过在Clariostar上的荧光井扫描方案读取的细胞海马运行完成后立即。该标记方法产生与此处测试范围内存在的单元数成比例的信号。可以使用附加到读取协议的计算模板自动计算和导出数据,然后可以轻松导入Seahors“Wave”软件以正常化结果。


NB.

  • Seahorse测定需要许多细胞,以确保它们保持健康的新陈代谢
  • 在宽范围内归一化可能引入代谢效应。瞄准每个孔的一致数量的细胞。
  • 归一化不是“治愈所有”:始终优化条件,不会稀疏或过于融合细胞。
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