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新型聚集特异性荧光剂利用荧光偏振(FP)监测纤维前蛋白聚集

David C. Thorn (1) Heath Ecroyd (4) John A. Carver (1) (1)澳大利亚国立大学化学研究院,澳大利亚(2)澳大利亚La Trowe University,澳大利亚La Trobe Solitular Science学院La Trobe Solitular Coursituts系(3)澳大利亚大学化学学院(4)澳大利亚卧龙岗大学Illawarra卫生和医学研究所生物科学学院 07/2018
  • 新型聚合 - 特定的FL uorogen(TPE-TPP)对Thio FL Avin T具有优异的特征
  • TPE-TPP通过FOROFECASCE偏振监测淀粉样蛋白蛋白质的预先峰状物种
  • Clariostar Microplate Reader提供稳定的测量,孵化和振动平台

表的内容

介绍

高度有序的蛋白质聚集体称为淀粉样蛋白Fi,与广泛的疾病有关,其中许多是神经变性的,例如阿尔茨海默氏症和帕金森。通过涉及初始动态早期聚集体或预先峰状物种的初始产生的复杂方法,从溶于溶于溶解的功能蛋白来不溶于淀粉样蛋白丝体。提出了预先峰状物种(二聚体,四聚体等),以在淀粉样蛋白FiRIS的细胞毒性中发挥关键作用。因此,正在积极寻求具有广泛适用性的新型探针。


我们最近报道过1一种新型的广谱荧光探针(双(三苯基膦)四苯乙烯(TPE-TPP)),具有发射特性,特别适合于使用各种荧光技术监测各种蛋白的纤维前聚集。在这里,我们描述了我们的荧光偏振(FP)的结果。


测定原理

FP使用平面偏振光测量溶液中分子的旋转。通常,小型流量诸如TPE-TPP在水中旋转。当用偏振光激发时,各个分子在发射前随机旋转。它们的发射光被降低极振并具有小的FP值。如果Fl uorophore与大蛋白质结合,则整个复合物缓慢旋转。来自复合物的发射光保持平面极化,FP值大(图1)。

该技术非常适合于研究蛋白质的淀粉样蛋白聚集,因为FP值取决于TPE-TPP /蛋白质复合物的增加且较少地取决于由溶液的不均匀性引起的流动性强度的流动性。在该研究中,检查了在减少和羧甲基化α-乳白蛋白(RCMα-LA),RCMβ-酪蛋白和胰岛素的聚集期间TPE-TPP的FP的变化。


材料与方法

  • Microplate 384 well, small volume, black (Greiner, #784900)
  • ThinSeal™(ExcelScientific Inc., #100-THIN-PLT)
  • CLARIOstar®板材读者,BMG Labte德赢vwin官网客服ch
  • 酰化和生物素化的组蛋白3衍生的肽(Lifetein)
  • 淀粉样蛋白Fi Brils.2: RCM α-LA(100µM);20毫米磷酸钠pH值为7.4,100毫米氯化钾,10毫米氯化镁2, 37°C,缓慢晃动。RCM ĸ-casein (50 μM);20mm磷酸钠pH 7.4, 37°C, 300 rpm。胰岛素(200μM);50 mM甘氨酸- hcl pH 2.0, 60°C
  • 染料浓度:20μm;总体积:20μl。

实验程序
在FP实验中,TPE-TPP与蛋白质在溶液中预先混合,然后在更高的温度下孵育。FP用CLARIOstar酶标仪原位记录,设置如下。在相应的蛋白纤颤条件下,减去相应缓冲溶液中tp - tpp的背景荧光,FP值的变化以微极化单位表示(mP)。


仪器设置

光学设置 荧光极化,板模式动力学
过滤器 前:360-20.
二向西:LP426
新兴市场:482 - 16
获得 频道:676
B频道:675
一般设置 闪烁 50
沉淀时间 0.1s.
动态设置 循环 770.
周期时间 120年代
孵化 α-LA,K-casein 37°C;胰岛素60°C
摇晃 α-LA:100 rpm怠速运动
K-casein:300 rpm闲置运动

结果与讨论

TPE-TPP表现出聚集的发射特性 - 具体:它没有给出具有稳定的熔母态的信号或无定数聚集物种1。该化合物可用于监测各种聚集蛋白在各种条件下的纤维聚集;酸性pH值,升高的温度和淀粉样蛋白抑制剂的存在。1重要的是,TPE-TPP可以通过标准荧光(数据未显示)和FP来监测原纤维物种。

牛胰岛素(单体质量5.8 kDa)在酸性pH值(pH 2.0)和高温(60°C)下形成淀粉样纤维。胰岛素在酸性pH值下以二聚体的形式存在,在较高的温度下迅速分解成单体,随后发生构象变化。部分未展开的单体相互结合形成二聚体、四聚体和六聚体等低聚体中间体。3.使用TPE-TPP对牛胰岛素单体低聚化的FP研究清楚地表明,随着FP值的逐步增加,从单体到低聚化,然后到胰岛素淀粉样蛋白原纤维的进展,每一个都大致相同的幅度(图2)。


RCM α-LA(单体质量14.7 kDa)遵循经典的成核聚合反应,其荧光动力学曲线为s型。4.从单体开始,孵育2h后形成了质量越来越大的可溶性低聚物,从FP值的急剧增加可以看出。随后形成了刚性不溶性纤维,FP达到最大值,并在接下来的8小时内保持不变(图3a)。


相比之下,RCM△ - 酪蛋白(单体质量〜19kDa)通过不同的机制形成淀粉样蛋白丝体,没有意义的滞后阶段。在25℃下的溶液中,RCMĸ酪蛋白作为球形颗粒发生,重均分子量为约1180kDa。与分子量差异一致,孵育前RCMĸ酪蛋白的FP高于RCMα-LA的差异(图3B)。在37℃和中性pH中,RCMĸ-酪蛋白组合成五棱圆形结构。通过RCMĸ-酪蛋白形成淀粉样蛋白FiRIB形成涉及将其球形,低聚形式的解离,以将其经历快速聚集以形成细胞核以形成核从哪个刚性,棒状淀粉样蛋白Fi Brils发育。6.

结论

以上结果清楚地表明,基于tpe - tpp的FP测量可以原位监测多种淀粉样纤维形成蛋白的纤维组装。此外,CLARIOstar多模读取器(BMG Labtech)是这些研究的通用工具,提供温度控德赢vwin官网客服制到65°C,重型震动,和高FP灵敏度。


参考文献

1. Kumar,M. Hong,Y.Et。al。肛门。化学。2017,89,9322-9329。
2. Kumar,M。洪,Y.et Al.1
3. Bekard,I. B .;Dunstan,D. E. Biophys。J.2009,97,2521-2531。
4.Kulig m;学生物化学Ecroyd, h。J. 2012, 448, 343−352。
5.Thorn, d.c.等。生物化学2005,44,17027-17036。
6. Ecroyd,H.等。J. Biol。化学。2008,283,9012-9022。

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