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通过荧光极化(FP)的新型聚集特异性荧光监测前纤维蛋白聚集(FP)

Manjeet Kumar(1)云宁洪(2,3)David C. Thorn(1)Heath Ecroyd(4)John A. Carver(1) (1)澳大利亚国立大学化学研究学院,澳大利亚(2)澳大利亚拉筹伯大学拉筹伯分子科学研究所化学系和物理系,澳大利亚(3)澳大利亚墨尔本大学化学学院,澳大利亚(4)生物科学学院,Illawarra健康和医学研究所,澳大利亚澳大利亚伍伦贡伍伦贡大学 07/2018
  • 新型聚合 - 特定的FL uorogen(TPE-TPP)对Thio FL Avin T具有优异的特征
  • TPE-TPP通过FOROFECASCE偏振监测淀粉样蛋白蛋白质的预先峰状物种
  • Clariostar Microplate Reader提供稳定的测量,孵化和振动平台

介绍

高度有序的蛋白质聚集体称为淀粉样蛋白Fi,与广泛的疾病有关,其中许多是神经变性的,例如阿尔茨海默氏症和帕金森。通过涉及初始动态早期聚集体或预先峰状物种的初始产生的复杂方法,从溶于溶于溶解的功能蛋白来不溶于淀粉样蛋白丝体。提出了预先峰状物种(二聚体,四聚体等),以在淀粉样蛋白FiRIS的细胞毒性中发挥关键作用。因此,正在积极寻求具有广泛适用性的新型探针。


我们最近报道了1一种新型的广谱流荧光探针:(双(三苯基膦鏻)四苯基乙烯(TPE-TPP)),发射特性TICS,其非常适合使用各种流动荧光技术监测各种蛋白质物种的预先磨削的预聚集。在此,我们描述了我们对荧光极化(FP)的结果。


测定原则

FP使用平面偏振光测量溶液中分子的旋转。通常,小型流量诸如TPE-TPP在水中旋转。当用偏振光激发时,各个分子在发射前随机旋转。它们的发射光被降低极振并具有小的FP值。如果Fl uorophore与大蛋白质结合,则整个复合物缓慢旋转。来自复合物的发射光保持平面极化,FP值大(图1)。

该技术非常适合于研究蛋白质的淀粉样聚集,因为FP值依赖于TPE-TPP/蛋白质复合物质量的增加,而较少依赖于溶液的不均匀性引起的荧光强度的波动。在本研究中,我们检测了还原和羧甲基化α-乳清蛋白(RCM α-LA)、RCM ĸ-casein和胰岛素聚集过程中TPE-TPP的FP变化。


材料与方法

  • 微孔板384井,小体积,黑色(Greiner,#784900)
  • Thinseal™(Excelscienti Fi C.,#100-Thin-PLT)
  • Clariostar.®平板阅读器,BMG LABT德赢vwin官网客服ECH
  • 乙酰化和生物素化组蛋白3衍生肽(LifeTein)
  • 淀粉样蛋白Fi Brils.2:RCMα-LA(100μm);在20mM磷酸钠pH 7.4,100mM KCl,10mM MgCl2,37°C,摇晃缓慢。RCMĸ - 酪蛋白(50μm);20mM磷酸钠pH 7.4,37℃,300rpm。胰岛素(200μm);50 mm甘氨酸-HCl pH 2.0,60°C
  • 染料浓度:20µM;总体积:20µL。

实验的程序
对于FP实验,在较高温度下孵育之前,将TPE-TPP预先混合在溶液中。使用Clariostar Microplate Reader原位记录FP,并在下面指出的设置。减去了相应的蛋白质Fillation条件下的相应缓冲溶液中TPE-TPP的背景流荧光,并且FP值的变化以毫光极化单元(ΔMP)表示。


仪器设置

视镜设置 荧光偏振,平板模式动力学
过滤器 前:360-20.
二向色性:LP426
EM:482-16
获得 频道A:676
频道B:675
常规设置 闪光 50.
建立时间 0.1s.
动力学设置 循环 770.
周期 120年代
孵化 α-LA, k-酪蛋白37°C;胰岛素60°C
摇晃 α-LA:100 rpm怠速运动
k-酪蛋白:300 RPM空转

成绩与讨论

TPE-TPP表现出聚集特异性的发射特征:它不以稳定的熔融球状态或非定形聚集物种发出信号1。该化合物可用于在各种条件下监测各种聚集蛋白的FRIL聚集体。酸性pH,升高的温度和淀粉样蛋白抑制剂存在。1重要的是,TPE-TPP可用于通过标准流动(数据未示出)和FP来监测预先峰状物种。

牛胰岛素(单体质量5.8kda)在酸性pH(pH2.0)和升高的温度(60℃)下形成淀粉样蛋白纤维。胰岛素作为酸性pH的二聚体存在,其在较高温度下迅速分离为单体,然后进行一致性变化。部分展开的单体彼此缔合形成寡聚中间体,包括二聚体,四聚体和六烷烃。3.使用TPE-TPP的牛胰岛素单体单体的FP研究清楚地表明了从单体到低聚物的进展,然后通过逐步增加,在FP值中围绕相似幅度的胰岛素淀粉样蛋白杂化物(图2)。


RCMα-LA(单体质量14.7kDa)遵循典型的成核依赖性聚合,从其乙状体动力学荧光曲线显而易见。4从单体开始,在孵育2小时后形成具有含量较大的可溶性低聚物,其通过陡峭的FP值的陡峭增加而形成。随后用FP形成刚性不溶解的FRILs,在接下来的8小时内达到最大值并保持恒定(图3A)。


相反,RCM ĸ-casein(单体质量~19 kDa)通过不同的机制形成淀粉样原纤维,没有明显的滞后期。在25°C的溶液中,RCM ĸ-casein以球形粒子的形式出现,平均分子量为~1180 kDa。与分子质量的差异一致,RCM ĸ-casein孵育前的FP高于RCM α-LA(图3b)。在37°C和中性pH下,RCM ĸ-casein组装成纤维结构RCM ĸ-casein淀粉样纤维的形成涉及到其球状、寡聚形式的解离,成为单体淀粉样原体,然后经过快速聚集形成一个核,从核中形成刚性、棒状的淀粉样原纤维。6

结论

上述结果清楚地表明,基于TPE-TPP的FP测量可以监测原位的各种淀粉样蛋白FIL-形成蛋白质的Fillar组装。此外,Clariostar多模式读取器(BMG LabTech)是这些研究的多功能工具,提供温德赢vwin官网客服度控制至65°C,重载振动和高FP灵敏度。


参考

1. Kumar,M. Hong,Y.Et。al。肛门。化学。2017,89,9322-9329。
2. Kumar,M。洪,Y.et Al.1
3. Bekard,I. B .;Dunstan,D. E. Biophys。J.2009,97,2521-2531。
4. Kulig,M。Ecroyd,H. Biochem。J. 2012,448,343-352。
5. Thorn,D. C.等人。生物化学2005,44,17027-17036。
6.Ecroyd, H.等。生物。化学学报,2008,283,9012-9022。

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