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orac测定以确定抗氧化能力

法兰卡甘克 德赢vwin官网客服 12/2014
  • 抗氧化剂能够中和反应性氧(ROS)
  • orac测定使用rotox®作为参考物质
  • MARS数据分析软件,具有预测的快速orac评估模板

介绍

在所有氧气消耗细胞中,代谢和氧化应激产生几种中间体和副产物,其统称为活性氧(ROS)。ROS是人体必不可少的中间体,但它们也参与了衰老过程,并在许多退行性疾病的发展中,包括癌症,心脏病,阿尔茨海默和帕金森。ROS对细胞结构和功能分子(即DNA,蛋白,脂质)危险,因为它们充当强氧化剂或自由基。生物抗氧化剂能够处理ROS;然而,它们在消除可能对身体损伤的所有自由基,氧离子和过氧化物方面并不完全有效。此外,ROS可以从暴露于其他外部来源,例如香烟烟雾,污染物,化学品和环境毒素。

用于确定物质的抗氧化能力的一种标准化方法是orac(氧自由基吸收能力)测定。ORAC测定基于通过热分解引发的过氧化化合物的过氧化化诱导氧化的抑制作用,例如[2,2'-偶氮二茴香(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)]。以这种方式,ORAC测定使用生物相关的自由基来源,并且它将抑制时间和抑制程度结合成一个量。该测定的最近的修饰包括使用Fl Uoutcein作为探头,适应高通量格式,以及测量亲脂,亲水和总抗氧化能力的物质的能力。这些修正阳离子以及没有洗涤步骤,非常简单地简化orac测定;由此使其理想地适合测量物质的抗氧化能力。


在此,我们描述了使用Trolox的orac-fl测定的应用®(维生素E的水溶性类似物)作为所有其他抗氧化化合物进行比较的标准。


测定原则

随着时间的推移,从APAP的热分解产生的ROS,将终止来自荧光探针FLUERSCEIN的信号。随后加入抗氧化剂产生更稳定的流动荧光信号,其具有根据抗氧化剂的容量(图1)的信号稳定性。通过评估软件随时间汇总数据点。然后将其与标准进行比较,Trolox®,并且表示为摩洛哥的微摩尔®每克或每毫升样品(Te / mol的μmole的样品(Te / ml的μmole)。

材料与方法

所有材料通过来自制造商的正态分布通道获得。

  • 配角®96良好的黑色不透明板,康宁肋骨
  • 荧光素钠,6-羟基-2,5,7,8-四甲基核 - 2-羧酸(Trolex®),L(+) - 抗坏血酸,EpicaTechin gallate,[2,2'-偶氮二氨基(2-甲基丙脒)二盐酸盐(aaPH)]是从Sigma-Aldrich获得的

测试协议
不同稀释的拖拉器®(200μm - 12.5μm)和样品化合物(抗坏血酸和表情酸盐,两种已知的抗氧化剂)在磷酸盐缓冲液(10mM,pH7.4)中制备。所有解决方案都应该每天新鲜制备。


在每个工作中,以下用三份移液:

  • 荧光素,150μl10nm溶液
  • 对于标准,25μl拖车®稀释
  • 对于样品,25μl样品稀释
  • 对于坯料,25μl磷酸盐缓冲液

将微孔板密封,然后在37℃下在恒温器微孔板培养箱中孵育30分钟,而不会摇动。或者,BMG LabTech微孔板读卡德赢vwin官网客服器本身可以进行孵育步骤。


孵育后,每90秒采用流动次数测量(EX。485nm,EM。520nm)以确定背景信号。在3个循环后,在船上注射器的帮助下注射25μl(240mm)aaPH。或者,也可以用多通道移液管手动添加APAP。

由于ROS发生器在添加后立即活动,因此必须尽可能快地完成。测试被恢复,荧光测量值高达120分钟。


仪器设置

Flyostar / Polartar Omega Clariostar. Pherastar.FS.
检测模式 荧光强度
方法 板模式动力学,顶视音
视镜设置 EX-Filter:EX485
EM-Filter:EM520
EX-Filter:EX485
EM-Filter:EM520
或单色仪:
前:483-14
EM:530-30
光学模块:
FI 485 520
周期 90秒
周期数 80

成绩与讨论

图2显示了拖车®不同浓度的信号曲线(相对流荧光单位与时间)。添加3个循环后,加入APH,导致依赖于滴水浓度的流动荧光信号的损失®


由于样本浓度是已知的,软件允许用户同时查看校准曲线。图3描绘了Trolex的空白校正的线性回归曲线®,抗坏血酸和epicatechin gallate。图形方式可以看到抗坏血酸是较弱的抗氧化剂®,而EpicateChin Gallate是一个更强大的。

获得Trolox的值®在所需浓度范围内具有已知浓度的抗氧化剂的等同物(TE)可以分开回归曲线的斜率:

在具有未知浓度的化合物的情况下,软件计算拖车®使用拖车的特殊稀释剂的等同物®校准曲线。


结论

ORAC测定是用于确定任何物质的抗氧化能力的常见和流行的工具。在易于使用的火星数据分析软件的帮助下,可以通过与Trolox的标准曲线相比直接估计物质的抗氧化能力®。可以使用当前状态选项实时遵循每个反应的进度。此外,使用车载注射器允许一致和可重复的数据。

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