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酶联免疫吸附试验及NADH/NADPH转换检测概述

我是戴尔·弗兰卡·甘斯克 德赢vwin官网客服 12/2014
  • 使用基于光谱仪的仪器测量的经典吸光度测定
  • 强大的火星数据分析软件用于增加测定窗口
  • 每孔在不到1秒的时间内获得完整的UV/Vis光谱(220-1000 nm)

表的内容

ELISA(405,420,450,492和650nm)

酶联免疫吸附测定(ELISA)是常用的生化测定,其可以检测样品中抗体或抗原的存在。将样品与识别抗原(或一抗抗体)的二次抗体一起温育,该抗原(或一抗)和生物缀合到酶。该酶与产生的底物(可以经历进一步反应)的反应,其产生可以测量吸光度变化的溶液(图1)

两种最常用的生物结合酶是马萝卜过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。AP的底物PNPP(对硝基苯基磷酸盐)在405 nm处吸收。辣根过氧化物酶(HRP)的底物是双氧水,双氧水与下列显色剂结合,可以用吸收光谱法测定:ABTS (2,2 ' Azino-di-(3-乙基苄噻唑啉磺酸))(405-420 nm), TMB(四甲基联苯胺)(650 nm或450 nm), OPD(邻苯二胺二盐酸盐)(492 nm)。


仪器设置

光谱纳米 Spectrastar / Fluostar / Polartar Omega Clariostar. PHERAstarFS.
检测模式 吸光度
方法 端点
光学设置 选择全光谱(220-1000 nm)或
选择频谱的一部分(350-530 nm)或
选择ELISA特异性和参考波长,
例如405 nm,450nm,492 nm和650nm

BMG 德赢vwin官网客服LabTech的控制软件提供预先定位的测定协议。只需要一个单击以开始测量。

模仿ELISA测定,黄色染料以不同的浓度使用(图2)。

450和430 nm处的吸光度测量线性回归(图3)显示选择正确的测量波长可以增加动态范围显着(> 13%)。

NADH/NAD和NADPH/NADP转换(340 nm)

NADH / NAD.+和NADPH /辅酶ii+是许多酶在许多细胞功能中使用的辅助剂,包括:能量代谢,线粒体功能,钙稳态,氧化应激,基因表达,免疫功能,老化和细胞死亡。减少nad+到NADH和NADP+对于NADPH可以在340nm处监测,因为氧化形式不在该波长处吸收光(图4)

仪器设置

光谱纳米 Spectrastar / Fluostar / Polartar Omega Clariostar. PHERAstarFS.
检测模式 吸光度
方法 端点
光学设置 选择全频谱(220-1000nm)或选择频谱的一部分(220-400nm)或
在340nm处选择NADH / NADPH标准波长

使用MARS数据分析软件,可以为NADP进行260和340nm的线性回归。+/ nadph或nad+/ NADH转换曲线(图5)。预期340nm处的信号的线性增加(图5中的示例导致r2= 0.99)。然而,与常规剂量响应曲线不同,在260nm处的线性回归显示信号的略微降低,因为NADPH浓度增加(图5,红线,R2= 0.93)。理论上,这个峰值应该没有斜率,因为二核苷酸的浓度是恒定的。然而,可能会有轻微的下降,因为似乎NADP+比NADPH在260nm处吸收更多光。可以对比率测量(340/260nm)(绿线)进行线性回归来校正此变化。

在表1中,NADH和NADPH的灵敏度取决于闪光的数量。

NADH. NADPH
闪烁 LODμm(ng / ml) LODμm(ng / ml)
96年好 20. 20 0.748 (497) 1.93(1610)
50 0.580(386) 1.58 (1322)
100. 0.465(309) 1.11(931)
384嗯 20. 3.761(2501) 1.80(1497)
50 3.418 (2773) 1.38 (1151)
100. 3.430(2281) 1.40(1169)

结论

BMG实验室的微孔读卡器都有一个紫外/可见光谱仪,可以在德赢vwin官网客服1秒内测量从220- 1000nm, 1,2,5和10nm分辨率下的任何吸光度范围。有了这种灵活性和速度,吸光度测定可以轻松快速地进行。


在这个应用笔记中,我们已经展示了分光计在测定酶联免疫吸附试验或需要辅助因子NAD的试验中的威力+,NADH,NADP+和NADPH。

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