337.

氧解离测定(ODA):基于分光光度法的血红蛋白-O2 AF Fi Fi Fi ins的筛选平台

Mira P Patel(1)Vincent Siu(1)Abel Silva-Garcia(1)清旭(2)Zhe Li(2)Donna Oksenberg(1) (1)生物系(2)化学系,全球血疗法公司,南旧金山,加州 06/2019
  • 发育了一种名为氧解离测定(ODA)的新型筛选测定
  • 测定基于血红蛋白脱氧期间观察到的光谱变化
  • 光谱纳米在n期间随时间捕获的光谱变化2除了微孔板室

介绍

血红蛋白(HB)是含有含铁的含铁球在所有脊椎动物的血细胞中。它主要进行气体运输的能力,主要是o2,使其对维持有氧代谢来说至关重要。


外源改性Hb亲和力的化合物2对于治疗多种疾病是可取的。削减Hb-o的修改器2当改善o的o时,af fi是有用的2需要,例如伤口愈合。此外,增加了HB-O2自动共组织可用于镰状细胞贫血可延迟脱氧镰刀HB的聚合。


在这里,我们描述了氧解离测定(ODA)。使用相对较高的吞吐量光谱纳米读96孔板。读者配备了可选的气体通风口,使n2可以直接添加到读取器和随时间收集的频谱数据以监测HB的脱氧。


测定原则

确定o2HB的AFINIFIS氧和脱氧-Hb之间的光谱差异(图1)。

2种形式的Hb之间的差异主要在Soret带(400-500nm)和Q频带(500-600nm)中看到,但每6分钟监测350至700nm的整个光谱,每6分钟监测2小时,而n2通过微孔板读卡器是流体。使用Excel的Linest功能分析光谱数据,并转换为含氧HB的%。


材料与方法

  • 96孔,半面积微孔板(μ透明底部,Greiner)
  • 光谱纳米配有气体通风口
  • 有关试剂和源的完整描述,请参见Patel等。1

实验程序
将3μm纯度Hb加入有或没有各种化合物的平板中。将平板密封并在37℃下在环境空气条件下孵育1小时。随后切断板并置于光谱中纳米哪种气态干燥2通过气体通风口施加。板材以下列方式读取:

仪器设置

视镜设置 吸光度,板模式动力学
波长范围: 350-770 nm.
常规设置 闪光次数: 22.
安定时间: 0.2 S.
动力学设置 周期数: 20.
周期: 360秒
摇动设置 摇动频率: 300 rpm.
摇动模式: 双轨道
摇晃时间: 60 s - 每个周期
孵化 37℃

成绩与讨论

图2将2小时的开头和结尾的Hb的光谱结果进行比较为n2。在实验过程中,SORET带的峰值峰值在415至430中有一个明显的右转。此外,在曝光开始时Q带(541和577nm)的2峰,在2小时结束时分解成一个峰(555nm)。

将随时间收集的20个光谱比较在380至700nm的波长范围内,结果表示为%氧气Hb。绘制%氧气Hb结果(图3),显示预期的Inx Hb随时间的预期降低。

然后在HB-O的良好表征变形模拟体内测试ODA2af fi nity。图4显示了ODA结果与Hb单独和在植物酸和GBT1118存在下的比较。

在GBT1118和Phytic acid存在下分析氧平衡曲线(OEC)与行业标准TCS血管分析仪显示HB氧合的差异(数据未显示)。将更广泛的ODA筛网与OEC结果进行比较,发现降低血红蛋白的氧亲和力,如植酸,如植物的血红蛋白,在ODA中最佳地评估。这些化合物由于低亲和力和快速位移而将ODA曲线移向左侧。然而,增加血红蛋白的血红素亲和力的化合物将ODA曲线延迟止动氧解离。这些化合物如GBT1118最好在108分钟内进行评估。这2个检测时间在图4中表明了。无论评估时间如何,使用ODA的结果与OEC相关并表现出可接受的稳健性统计(数据未显示)。


结论

ODA代表了对HB-AF Fi Fi Fi Fi的分析中HTS的重大步骤。与行业标准相比,ODA改善了筛查检测所需的时间和体积。


参考

1. Patel,MP等人。氧解离测定的开发和验证,发现筛选平台,并表征血红蛋白 - 氧气自动化杂志。药物des。开发。它。(2018)12:1599-1607。

去顶级