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Pherastar FS:用于复杂HTS测定的多模微孔板读卡器

Marjan Orban(1)Silke Angersbach(1)Randy Hoffman(2)Megan Buros(2) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech(2)Invitrogen Corp. 02/2005
  • 远红色波兰人™
  • 激酶测定AlphaScreen cAMP竞赛分析
  • HTRF®TNFa免疫测定

介绍

在过去的15年里,药物发现的高通量筛选(HTS)方法在过去的15年里获得了广泛的普及。由于需要每天处理数千个测定,因此HTS依赖于多井微孔板和机器人加工技术。吞吐量增加和成本降低的压力导致采用高密度,较小的微孔板以及快速,均匀,小型化的筛选测定。


德赢vwin官网客服BMG LABTECH的PHERAstar®FS结合高温超导所需的快速板读数与读取小液体体积所需的增强性能和灵敏度。pherstar的性能和特点FS在本应用笔记中介绍了商用高温超导套件,如Far Red PolarScreen™,alphascreen.®,HTRF®


材料与方法

远程红色Polarscreen™激酶测定
在荧光偏振模式下,在低体积384孔板(来自康宁公司)中使用远红色PolarScreen™酪氨酸激酶(Csk)检测(Life Technologies),根据试剂盒方案,最终检测体积为20 μL。远红光荧光团在610 nm处被激发200次,在670 nm处两个偏振面同时探测到发射。

alphascreen.®营地比赛
营地测定套件(PerkinElmer)在字母表中进行®按照试剂盒检测方案,采用白色384孔小体积板(Greiner Bio-One)检测,最终检测体积为25 μL。的AlphaScreen®用400℃激发珠子,在680nm处,同时检测到520nm至620nm的发射。为了避免蒸发,在孵育或储存期间,用透明微孔板密封剂密封所有板,并且在读取微孔板期间未去除密封剂。


HTRF®TNFa免疫测定
使用HTRF探索了时间分辨的荧光模式®用于校准HTRF的读卡器(CISBIO)®兼容的读者。根据试剂盒方案,在384孔小体积板(Greiner)中获得结果。室温孵育过夜,终量为20 μL。该试剂盒基于肿瘤坏死因子(TNFa)检测,也可用于reader验证。基于闪光灯的pherstarFS,每口井进行200或400次闪光检测。在3337nm激发FRET供体隐酸铕(europium cryptate),在620 nm和665 nm同时读出发射。


成绩与讨论

远程红色Polarscreen™激酶测定
Far Red PolarScreen™分析在均相荧光偏振分析中采用专有的Far Red荧光团。


蛋白激酶(PKS)是涉及细胞信号传导的许多区域的不同酶组。这些包括细胞生长和增殖和神经功能。对PKS的敏锐兴趣源于其在调节生物机制方面的作用。通过磷酸化,PKS参与许多细胞信号转导过程。研究重点研究激酶活性最终识别可用于开发新的药剂以治疗许多这些疾病的目标。


深红色的激酶测定允许激酶,底物和ATP在文库化合物存在下反应。反应完成后,加入抗体和远红色标记的示踪剂。抗体可以与标记的示踪剂(导致高FP值)或激酶制成的磷酸化基板相关联(导致较低的FP值)。与示踪剂结合的抗体量与存在的磷酸化产物的量与存在的磷酸化产物的量呈逆转,以这种方式,可以通过降低FP值检测激酶活性并测量。因此,抑制反应的文库化合物被鉴定为具有高偏振值的孔。

演示pherstar的用法FS对于Invitrogen的远红球卷发™激酶测定,在0.5pg / ml至2μg/ ml CSK的浓度范围内进行酪氨酸激酶(CSK)滴定曲线(n = 3),如图2所示。1。

alphascreen.®营地比赛
循环放大器(营地)是最重要的细胞内介质之一。用alphascreen检测营地®是基于细胞产生的cAMP和夹在链亲和素供体和抗cAMP抗体偶联受体珠中的生物素化cAMP探针之间的竞争。信号的减少可以观察到细胞内cAMP产生的增加。在细胞内没有cAMP的情况下,检测到最大信号。演示AlphaScreen的功能®分析和Pherastar的表现FS,用cAMP绘制滴定曲线(n = 3)(图2)。

最终测定体积为25 μL /孔置于384孔的SV板中,室温孵育12小时后在PHERAstar上读数FS每口井的积分时间为0.3秒。cAMP的浓度范围为1 μM ~ 10 pM, S/B = 82。使用包括4参数拟合函数的MARS评估软件进行曲线拟合和IC50测定。计算出的IC50值为24 nM,符合文献的要求。这些实验评价表明,pherstarFS可以为alphascreen产生高质量数据®测定技术。


HTRF®TNFa免疫测定
Cisbio的HTRF.®分析采用荧光欧盟3+在基于均匀时间分辨的fret测定中的cryptates(供体)和XL665(受体)。


肿瘤坏死因子(TNFa)是一种17 kDa的细胞因子,是由活化的巨噬细胞和单核细胞分泌的重要介质,具有广泛的抗病毒免疫调节、代谢和炎症特性。的HTRF®TNFA测定是一种涉及用铕缀合的两种MAb缀合的单步双位免疫测定法,或者XL665。的HTRF®TNFA测定原理如图3所示。3。

在其最终配置中,校准器或样品的免费TNFA由小鼠MAB IPM2-EU加密(IPM2-K)和小鼠MAB IPM3-XL665(IPM3-XL665)缀合物夹在中间。由两个缀合物同时结合产生的褶皱信号与样品中存在的TNFA的量成比例。在Pherastar上同时测量665nm和620nm信号。


ΔF是由665nm / 620nm比率计算的值,该值使得能够相对于测定变型归一化数据。此外,Delta F是读者独立的,可用于指示和比较读取器的质量。该PHERAstar FS结果在一个优秀的delta F值(> 1100 %高校准)。


结论

通过HTS发现新的导线是基于精确测量生物分子相互作用的能力,并找到与小型HTS兼容的成功检测策略。Pherastar.FS多模微孔板读卡器证明有广泛的可能应用高温超导的需求。

Polarscreen是Invitrogen的注册商标。

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