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Pherastar FSX认证用于纸张测定

弗兰卡·莫尔(1)Meera Kumar(2) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech(2)Bellbrook实验室 02/2016
  • 检测HTS格式的酶活性
  • Pherastar.®FSX.配备轨道特定光学模块,测量远红染料的信号
  • 高灵敏度数据具有读取时间<30秒的整个384孔微孔板

介绍

账面®来自Bellbrook Labs的测定提供了一种可用方法来检测高通量筛选(HTS)格式的酶活性。测定基于直接检测核苷酸,例如ADP,GDP,UDP,GMP和AMP,允许确定例如e.g的活性。甲基转移酶,乙酰转移酶,激酶或GTP酶。该测定使用远红染料,有三种检测模式提供:

  • 透气液FP(荧光极化)
  • 透气仪FI(荧光强度)
  • 透气仪TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)

在本申请中,我们展示了Pherastar的表现FSX.来自BMG LabTech的麦片类读卡器在轨道德赢vwin官网客服仪中®测定。在验证测量中,输出值导致高灵敏度数据,而每384孔微孔板的读取时间可以是<30秒。将仪器与HTS进行完善的选择。

测定原则

在样品中存在酶促反应ADP之后。图2中示出了不同种类的ADP检测的一般描述。1。

播放器FP原则

用alexa633标记和与抗体缀合的Adp标记。在酶反应过程中产生的ADP将与ADP抗体的结合位点与Alexa633-Adp竞争,并将取代Alexa633-ADP。这将导致衰减的FP值。

账面FI原则

用Alexa594标记的Adp标记与携带猝灭剂的抗体缀合。在酶反应过程中产生的ADP将与ADP抗体的结合位点与Alexa594-ADP竞争,并将取代Alexa594-ADP。将Fl荧光染料和猝灭剂带入距离导致的距离导致。

透气仪TR-FRER原理

用受体染料HILETE647缀合的ADP标记与携带供体铽螯合物的抗体缀合。在酶反应期间产生的ADP将与ADP抗体的结合位点与HILETE647-ADP竞争,并将置换标记的ADP。将TR-FRET供体和受体带出近距离,并导致TR-FRET信号的降低。

材料与方法

  • 纸张®ADP2 FP,FI,TR-FRET测定套件
  • 黑色384-井小体积,低绑定板(Greiner)
  • Pherastar.FSX.微孔板读者

制备ADP / ATP标准以模拟酶促反应。在不同比例下组合10μMADP和10μMATP溶液以产生不同百分比的ATP转化为0至10μm。将10μL标准和10μLAdP检测混合物(含ADP抗体和ADP远红色示踪剂)组合在微孔板中,并在室温下温育1小时。孵育后,在pherastar中测量板材FSX.

Pherastar FSX仪器设置

Transcreener FP. 透气仪FI. 透气仪TR-FRET
同时双排放 是的 是的
光学模块 FP 590 675 675 FI 580 620. TRF 337 665 620
激励源 闪光灯 闪光灯 激光或闪光灯
int。开始:50μs
int。时间:50μs
获得/焦点 应在测量之前调整

成绩与讨论

Transcreener FP.

图2显示了与PherastarFSX.已达到高于200mP的测定窗口(测定窗口= 100%ADP的100%ATP值的值)。

表1中显示了闪光数量对测量稳健性的影响。

F灰烬数量 100. 50. 25. 13.
δmm为10%
转换
156. 157. 158. 158.
z'at 10%
转换
0.878 0.819 0.780 0.749
阅读时间
全384W板材
3分钟
31秒
2分钟
26秒
1分钟
53秒
1分钟
37秒

对于整个384孔微孔板,可以在不到2分钟的时间内可靠地测量测定。


透气仪FI.
透气仪FI信号随着ADP浓度的增加而增加。根据认证要求,有必要在10%ATP转换下获得0.7的Z'因子。图3显示了与pherastarFSX.该Z'Factor以4%的转换实现,远低于认证要求。

透气仪TR-FRET
可以通过使用Pherastar中的闪光灯或激光来执行TR-FRET测量FSX.。用激光获得的标准曲线如图4所示。4。

闪光灯和激光在测定窗口和数据稳定性方面提供可比数据。激光器的优点是使用较少的闪光。在飞行模式中,整个板可以在不到30秒的时间内读取(表2)。

闪光灯闪光灯 Z'值 阅读时间 闪光激光器 Z'值 阅读时间
50. 0.815 2分钟
27秒
10. 0.896 2分钟
21秒
25. 0.807 1分钟
53秒
5. 0.884 1分钟
49秒
10. 0.747 1分钟
33秒
1 0.830. 1分钟
23秒
5. 0.746 1分钟
26秒
飞行 0.736 27秒

Bellbrook实验室的验证标准

  • 384井格式
  • Z'-因子≥0.7,10%转换为10μmatp
  • Δmp≥95mp,10%转换为10μmatp
  • 读取时间达到规格≤5分钟

结论

基于Pherastar所示的数据FSX.已获得所有三个播放器认证。

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