320

PHERAstar测量AlphaScreen含量,开发用于人类叶芝领域的选择性抑制剂

托马斯·克里斯托特·卡门·考克森·詹姆斯·贝内特·查林·吉鲁·奥克托维亚·蒙泰罗·奥列格·费多罗夫 结构基因组学联盟,牛津大学,英国 04/2018
  • PHERAstar®FSX为药物发现提供高通量平台
  • 筛选几个文库得到了ENL的叶芝域抑制剂

表的内容

介绍

近年来,叶芝域加入了表观遗传调控的行列,与溴域、PHD fingers等一起被认为是组蛋白翻译后修饰(HPTM)的真正读者。叶芝结构域与赖氨酸结合时ε-碳被乙酰化或巴豆化1。与乙酰化不同的是,巴豆化在主动翻译中的意义尚不清楚2。的YEATS-containing ENL已被证实为主要驱动力的几种类型的急性白血病和链接组蛋白乙酰化作用进一步活跃转录(图1)。对此,CRISPR / Cas9-mediated击倒ENL减少恶性进展期细胞系的行为,而其完整的叶芝领域促进进展期生长3,4.。这些观察表明,ENL是一种抑制异常细胞生长和恶性肿瘤的合理药物靶点,因此是正在进行的药物发现计划的靶点。

在这里,我们介绍了一种选择性抑制剂的叶芝领域的ENL。我们希望为叶芝家族的每一个成员开发化学探针,作为研究其生物学功能的工具化合物。


测定原理

我们使用PerkinElmer alphascreen®组氨酸检测试剂盒由链霉抗生物素蛋白涂覆的“供体”珠子和镍螯合剂涂覆的“受体”珠粒组成。在680nm处用光的供体珠的激发驱动氧气在溶液中的氧气转化为激发态氧气(1O.2)。接受珠将单态氧的能量转换为光,转换范围为520 - 620 nm(图2)。由于单态氧的半衰期较短,供体和接受珠必须接近才能成功转移能量。通过链霉亲和素将供体珠与酰化的组蛋白3结合,受体珠与叶芝结构域结合,当蛋白质和肽相互作用时,两个珠被聚集在一起。中断蛋白质-肽的相互作用(因此增加了相关的供体和受体珠之间的距离),减少信号并提供可测量的输出。

材料与方法

  • PHERAstarFS.FSX带堆垛机(BMG LABTE德赢vwin官网客服CH)
  • Labcyte®回声®液体处理程序
  • AlphaScreen®组氨酸检测试剂盒(PerkinElmer)酰化和生物素化的组蛋白3衍生的肽(Lifetein)
  • 6HIS标记的ELI,AF9,YEATS2和GAS41(在房屋生产)
  • 384孔ProxiPlates (Perkin Elmer),测定体积为20µl

仪器的设置

光学设置 AlphaScreen、端点
光学模块: AlphaScreen 680 570
获得: 3500
一般设置 安定时间: 0.0秒
激发时间: 0.06秒
集成开始: 0.09秒
积分时间: 0.20秒

实验程序
使用回声将化合物分配到板中®液体处理器(最终试验浓度50µM为单次实验,最高浓度200µM为剂量响应曲线)。


蛋白、肽和化合物孵育30分钟后加入AlphaScreen®珠子(1:6)。然后培养皿在阅读前至少孵育60分钟。


一个含有生物素的反屏6.肽代替[生物素]肽:叶芝- his6.还进行了配对,以识别并排除假阳性(如金属螯合剂或荧光猝灭剂)。


结果与讨论

分析优化
为了确定最佳的测定条件,我们首先对每种蛋白制剂进行蛋白与肽的滴定。然后选择蛋白与肽的摩尔比进行筛选(图3),该摩尔比的微小偏差不会导致发光信号的显著变化。

检查活动
几个库(包括一个内部溴域抑制剂库,以及安大略癌症研究所的16k和24k化合物库)首先以“单次注射”的形式对ENL进行筛选(50µM最终试验浓度,一式两份)。在这里显示出抑制作用的化合物在较低浓度下重新测试,以建立效价。其中,>80%抑制率低于50µM的化合物继续使用AlphaScreen对所有4个人YEATS结构域(ENL, AF9, YEATS2, GAS41)进行全浓度-响应曲线分析®化验。对于最有效的化合物,IC50ENL:H3K18ac(2.7µM)和AF9:H3K9ac(7.3µM),而没有IC50可以确定YEATS2A:H3K27cro和GAS41:H3K9ac在测试浓度范围内的值(图4)。

结论

我们已经鉴定出一种有效的小分子抑制剂,可以抑制密切相关的ENL和AF9,对另外两种含叶芝结构域的人类蛋白(YEATS2和GAS41)具有选择性。原始AlphaScreen的结果®筛选活动与正交测定吻合良好(数据未显示)。


的PHERAstarFSX为药物发现活动提供了一个强大而通用的平台。这里,我们用AlphaScreen筛选了数万种抑制叶芝结构域的化合物®方法导致有效的小分子抑制剂的识别。


参考文献

1. Y. Li,H. Wen等人。(2014)AF9 Yeats域将组蛋白乙酰化与DOT1L介导的H3K79甲基化联系起来。细胞,Vol。159,没有。3,pp。558-571
2. A. Dutta,S.M. Abmayr,以及J.L.工人(2016)组蛋白酰化的不同活动将代谢与染色质功能联系起来。摩尔。细胞,Vol。63,否。4,pp。547-552
3.m.a. Erb等(2017)ENL YEATS域在急性白血病中的转录控制。自然
4.L. Wan等人(2017)ENL将急性髓系白血病中的组蛋白乙酰化与致癌基因表达联系起来。自然

去前