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预测hERG荧光偏振分析试剂盒在PHERAstar FS上进行

ej戴尔 德赢vwin官网客服 12/2008
  • 预测 - 生成IC50.与Patch-Clamp电生理学的值紧密相关的值
  • 非酰基活性 - 利用荧光极化示踪剂消除放射性配体
  • 添加和读取 - 以均匀的测定格式启用高通量HERG责任筛查

表的内容

介绍

心脏毒性副作用的可能性继续挑战基于小分子的疗法的发展。这些难以忍受的副作用通常通过药物诱导的长QT综合征(LQT)来沉淀,其通常与阻断人醚-A-Go-Go-Go相关基因(HERG)钾通道相连。尽管贴片电生理仍然是用于测定化合物与Herg通道功能相互作用的金标准,但是已被证明是在复合发育早期阶段的HERG信道责任的成本效益初始替代测定。然而,速度和成本仍然遭受,因为放射性配体置换测定保持异质并取决于放射性配体的采购和处理成本。由于FDA建议测试所有新药候选人进行堵塞HERG频道,因此在发现过程中早期的分类化合物的简单,安全,经济有效的方法都有压迫需求。


为了解决这种需求,预测器TM值已经开发出来自Invitrogen的Herg荧光偏振测定试剂盒。测定基于荧光偏振的原理(FP),其中红移荧光示踪剂通过与通道结合的化合物从HERG通道移位。当示踪剂绑定到信道时,FP值高,并且当由HERG结合化合物移位时,FP值低(图1)。

测定试剂盒包括稳定的膜制剂,其含有高水平的HERG蛋白,以及优化的示踪剂,缓冲液和进行测定所需的对照。本技术说明描述了预测器的性能TM值Herg测定在BMG Labtech德赢vwin官网客服的Pherastar上®FS.多功能HTS微孔板读卡器。


德赢vwin官网客服BMG Labtech的PherastarFS.是一种多竞争介质读卡器,将高通量筛选(HTS)所需的快速板读数相结合,具有读取小流体容积所需的增强性能和灵敏度。Pherastar.FS.可读取所有HTS检测模式(荧光强度、时间分辨荧光、荧光偏振、发光和吸收)的所有平板格式,最多可达1536孔。Pherastar.FS.使用独特的应用专用光学模块结合读取头,该读取头具有五个光电倍增管,其可以同时测量任何所需波长的两个发射信号。该同时的双发射(SDE)检测在Pherastar FS上提供出色的荧光偏振测定中的优异灵敏度和精度,最小化读取时间和增加Z'值。


材料与方法

  • Pherastar.FS.带预测的微孔板读者TM值FP模块(540-20 / 590-20),BMG L德赢vwin官网客服abtech
  • 黑色384低康宁的低卷微孔板
  • 预测TM值来自Invitrogen的Herg荧光偏振测定试剂盒

遵循预测指标TM值HERG荧光偏振测定试剂盒说明。简而言之,将10μL稀释系列的化合物置于384孔板(重复)中,然后添加5μL的示踪剂和疱疹膜制剂。然后可以在1和24小时(或更多)孵育之间的任何时间读取板。


结果与讨论

已知hERG阻滞剂的竞争性结合
在预测器中测试了先前已显示阻断HERG通道的十种化合物TM值利用BMG LABTECH PHERAstar进行hERG荧光偏振分析德赢vwin官网客服FS.(图2)。

偏振数据如图2所示,与先前在表1中先前报道的贴片夹或放射性配体的数据进行了总结和比较了数据的数据。跟踪器从FP测定中的膜的非特异性位移(观察到通过将位移曲线的基线固定到具有饱和水平(30μm)的E-4031所见的值来校正在高浓度下的化合物,观察到没有特异性样力的化合物。

我知道了50.(纳米)
化合物 预测TM值FP. 补丁夹 放射性配体
E-4031. 27. 48. 20.
amittiptyline. 7118. 10000 2440.
Haloperidol. 167. 174. 90.
氟西汀 2687 990 2230.
Dofetilide. 11. 12. 40
Astemizole. 3. 1.2 1
Terfenadine. 23. 16. 30.
pimozide. 8. 18. 6.
硫嗪. 553. 1250. 510.
Bepridil. 230. 550. 170.

测定Z'值的测定
通过测量含有30μME-4031(完全取代Tracer与Herg)或没有化合物的对照孔来评估测定鲁棒性。所有井都包含1%DMSO。数据如图3所示,确定0.86的Z'值。虽然这里未显示,测定在DMSO,甲醇或乙醇浓度下稳定,高达5%。

结论

由于hERG拮抗剂具有潜在的致命作用,FDA建议所有化合物在人体测试之前,都要通过电生理(膜片钳)试验来测试其作用。由于需要高度专业化的设备和专业知识,这种测试通常只在发现过程的后期阶段进行。虽然hERG通道功能的评估仍将是评估hERG通道阻塞的金标准,但结合分析可用于对化合物进行分类,并在早期过程中识别潜在的责任。最近开发的PredictorTM hERG荧光偏振分析试剂盒提供了一种均质分析格式,避免了使用放射性同位素来满足这一需求的问题。此外,PHERAstarFS.多功能HTS微孔板读卡器提供最快,最敏感的平台之一,以运行此FP测定。

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