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Promega的ADP-Glo激酶检测

Sarah Shultz(1)弗兰卡甘糕(2)ej戴尔(2) (1) Promega Corporation (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 12/2009
  • ADP-GLOTM值激酶测定是一种均匀的发光测定以检测ADP
  • 可以检测到1mm至0.01μm的ADP浓度范围

介绍

激酶是一种涉及许多细胞代谢和调节过程的大型和多样化的酶组。在激酶反应期间,底物磷酸化,而ATP转化成ADP。用于活性激酶或激酶抑制剂的筛选是开发新药的重要工具。为了满足这种需求,Promega开发了一个激酶测定这是基于发光和副产品ADP。ADP- glo™激酶测定法是一种通用的、均匀的、高通量筛选方法,通过定量激酶反应过程中产生的ADP的数量来测量激酶活性。该方法可用于筛选任何产生adp的酶。


在本应用笔记中,我们将展示用BMG LABTECH的多检测酶标仪获得的ADP-Glo激酶检测结果。德赢vwin官网客服


测定原则

测定的原理在图1中介绍。

该测定由两个步骤组成。完成酶反应后,井中存在ATP和ADP。第一步是添加ADP-Glo​​™试剂,导致消除剩余的ATP。第二步是通过添加激酶检测试剂将剩余的ADP转化为ATP。该试剂还包含在荧光素酶/荧光素反应的帮助下测量新产生的ATP所需的一切。孵育后测量的发光与在酶反应期间产生的ADP浓度成比例。

材料与方法

  • White 384-来自Greiner的井小容量盘
  • 来自Promega的ADP-Glo​​™激酶测定,包括ATP和ADP
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器

为了模拟酶促反应,由随着试剂盒供应的核苷酸储备溶液制备ADP / ATP标准曲线。该测定允许从1 mm的ADP测量到0.01μm的ADP。制备了四种不同的ADP / ATP标准曲线:1mm,100μm,10μm和1μm。作为一个例子,下面给出1mM ATP / ADP标准稀释度的稀释表。所有其他标准曲线相应稀释。

毫米 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9. S10 S11 S12
ADP. 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.
atp. 0. 0.2 0.4 0.6 0.8 0.9 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99 1

将5μL标准稀释液与5μLADP-Glo​​™试剂混合,然后在室温下孵育40分钟。之后,然后用船上注射器注射10μl激酶检测试剂。每分钟测量信号40分钟。或者,可以在室温下40-60分钟孵育后测量终点发光。


动力学反应的仪器设置

检测模式。 发光,板模式
测量时间: 1秒
周期时间: 60秒
周期: 40.
光学: 专用发光光学
获得: 优化ADP浓度

成绩与讨论

图2显示了1 mM ADP/ATP标准稀释的信号曲线。

信号曲线显示,在20分钟后,信号非常稳定。12标准根据其ADP浓度显示不同的信号高度。信号曲线的最后10个数据点被平均并作为线性回归拟合的基础

如图3所示,这种适合于1mm核苷酸标准曲线。使用相同的增益设置来为1μm标准曲线创建数据(图4)。

可以使用指示高测定窗口的相同增益设置测量1mm至1μm的标准曲线。


结论

本应用笔记中的数据证明,BMG LabTech介质读卡器可以成功地执行ADP-Glo德赢vwin官网客服TM值仅使用20μL的384孔格式从Promega测定激酶测定。配备在船上注射器,可以选择使用动力模式或作为端点测量在线在线反应。

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