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Promega的多路细胞活力和凋亡检测

Tracy Worzella Brad Larson Promega集团。 12/2014
  • 复用基于细胞的基于细胞的测定,用于分析来自单个样品的不同参数
  • 监测来自测定的发光和流出荧光输出信号
  • 测定小型化高达1536孔格式

表的内容

介绍

今天的高通量筛选设施面临着越来越多的需求,需要从现有的化合物文库中生成更多的信息。获得这一信息的一种方法是依次进行试验,在不同的样品板上依次观察一个参数。虽然该选项可能产生所需的数据,但增加的时间和可消耗的成本是缺点。一种更有吸引力的数据生成方法是以多路格式进行分析,在同一口井中可以测量多个参数。这种多路复用格式不仅节省了时间和可消耗的成本,而且还节省了有价值的测试化合物的使用。这里使用几个基于细胞的试验多路复用来演示多路分析的概念。细胞检测有其固有的特性,这使得它们对基于细胞的多路应用具有吸引力。基于细胞的检测尤其容易受到各种变化的影响,这是由于不同板间细胞生长和代谢的差异造成的。细胞培养本身也很昂贵。通过多路分析,较少的细胞需要获得相同数量的数据。 Using the same cells for subsequent assays can also ensure more precise data. In this application note, we demonstrate the combination of several Promega cell-based assays multiplexed in both low-volume 384- and 1536-well plate formats. Table 1 + 2 highlight the assays used in this application note.


表1:用于多路复用应用的基于单元的测定,设置1。

试验/检测模式 测定描述
Celltiter-Glo.®发光 细胞活力的基础上定量的ATP在活细胞中培养。发光与活细胞的数量成正比。
EnduRen™发光 Renilla荧光素酶报告器经由受保护的Coelenterazine底物设计,设计用于产生Renilla活细胞发出的发光。一旦进入细胞内,底物的保护基团被细胞内酯酶切断,产生与之反应的腔肠嘧啶Renilla产生光。在添加衬底1.5小时后达到峰值发光
细胞,信号稳定24小时>。
ViviRen™发光 Renilla荧光素酶报告器经由受保护的Coelenterazine底物设计,设计用于产生Renilla活细胞发出的发光。一旦进入细胞内,底物的保护基团被细胞内酯酶切断,产生与之反应的腔肠嘧啶Renilla产生光。底物加入细胞2分钟后达到峰值发光,信号半衰期为8 - 15分钟。

表1:用于多路复用应用的基于细胞的测定,设置2。

试验/检测模式 测定描述
Caspase-Glo®3/7
发光
通过zdevd荧光素衍生物裂解凋亡细胞的caspase-3和caspase-7活性。荧光素与荧光素酶、ATP和氧气反应产生光。光输出与半胱天冬蛋白酶活性成正比。
Apo-ONE®
荧光
caspase-3和caspase-7在细胞凋亡中通过ZDEVD-R110底物的切割。R110离去基发出强烈的荧光。R110荧光与半胱天冬蛋白酶活性成正比。
CellTiter-Blue®
荧光
基于活细胞转化氧化还原染料(转茄素)的细胞活力转化为荧光端(Resorufin)。可行细胞保留将转氮素减少成超凡素的能力,而非活细胞会失去这种能力。荧光与活细胞的数量成正比。

材料与方法

  • 专用Promega测定套件
  • 康宁低卷384孔板
  • 康宁1536 -孔板

多路复用细胞活力和细胞凋亡测定

Promega的荧光CellTiter-Blue®细胞活力测定与发光Caspase-Glo的其中一种多路复用®3/7检测,或者荧光载脂蛋白- 1®化验。


复用荧光素酶报告和细胞活力测定
Promega的发光Celltiter-Glo®试验用发光的endren™活细胞底物或发光的ViviRen™活细胞底物复用。


分析缩微至1536孔格式
对于1536孔的分析格式,每孔用Deerac流体赤道镀4000个稳定转染的细胞密度。对于小体积384口井,采用了相同的多路传输协议(有关方法的更详细信息可以在下面找到)www.docksidequiltgallery.com)。


结果与讨论

细胞活力和多路复用细胞凋亡检测图1和图2显示了两项实验的结果,以确定不同浓度的抗fas抗体在Jurkat细胞中引起的细胞死亡的方法。这两个实验测量了两个不同的终点:以青天蓝染料的减少作为活细胞的指标和以半胱天冬酶活性作为凋亡细胞的标记。结果表明,随着抗fas抗体浓度的增加,caspase-3/7活性升高,细胞活力降低。

结果表明,在治疗范围内,由于细胞凋亡的增加,而不是坏死,所研究的细胞群的存活率较低。对于所有的细胞活力和凋亡多路复用组合,1536孔格式的结果与384孔格式的结果相当。


荧光素酶报告基因及细胞活力测定
关联Renilla荧光素酶报告基因信号的细胞活力,Promega的CellTiter-Glo®使用endenren™活细胞底物或ViviRen™活细胞底物进行多重试验。发光报告信号测定后,用荧光传感器检测细胞荧光®在每个测点加入试剂灭活Renilla并开始atp依赖的发光,这被记录来测量细胞活力(图3和4)。

使用活细胞报告底物,可以跟踪a的反应Renilla实时报道。包括细胞活力试验,使一个相关报告反应与总细胞数。


结论

从1536孔格式中的小型化测定的数据与低体积384中的那些相当,表明较小的测定体积不会损害以较高密度格式获得的结果。

Apo-ONE是Promega的商标。

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