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Promega的P450- glo发光细胞色素P450检测使用BMG LABTECH的酶标仪德赢vwin官网客服

James Cali (1) EJ Dell (2) (1)Promega Corporation(2)BMG德赢vwin官网客服 Labtech 04/2007
  • 使用Promega P450-Glo的细胞色素P450抑制剂筛选TM用BMG LABTEC德赢vwin官网客服H酶标仪检测
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech专用发光检测系统提供了强大的信号并最大限度地减少了背景噪声
  • 快速可靠的检测细胞色素P450活性

介绍

一大群称为细胞色素P450(CYP或P450)的酶负责许多异种型疏水化学物质的氧化代谢,包括大多数治疗药物。P450新陈代谢可以在毒品,毒性和与其他药物的相互作用中的清关率。对于药物发现,研究人员需要确定新药分子如何通过P450酶代谢以及它们如何改变P450活性。这些测定中的一些可以通过使用已知的P450基板来实现,作为在与P450反应时以可测量的方式改变的探针。如果在药物存在下探针的反应性改变,则可以得出结论,该药物对P450活性产生影响。如本文所述,如果它们通过探针基板降低P450酶的反应性,则可以找到新的P450抑制剂。


德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板读取器是一种灵活的多功能微孔板读取器,可配备专用的发光检测系统。该系统允许测量强发光信号,同时保持低背景噪声。

试验设计

P450- glo™检测使用发光的P450探针底物,是甲虫荧光素的衍生物,荧光素酶的底物。这些衍生物不是荧光素酶的底物,而是通过不同的P450同工酶转化为荧光素(图1),而荧光素又与荧光素酶反应产生可测量的光量,光量与P450活性成正比。

将光学基质与活性P450制备一起温育。通过在产生“发光型”发光信号的专有缓冲系统中,通过在专有的缓冲系统中添加超GLO™Luciferase,重组,稳定的荧光素酶检测到P450活性和荧光素。发光输出的半衰期大于两个小时,允许批料板加工。

材料与方法

  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板阅读器
  • 不透明,FL底部96井肋骨®pl
  • Promega P450的如果TM筛选体系(含含人细胞色素P450酶杆状病毒膜制剂、发光底物(图1)、NADPH再生液、荧光素检测试剂、反应缓冲液、无荧光素水):CYP1A2 (catalog # V9770)、CYP2C9 (#V9790)、CYP3A4 (#V9800)、CYP2C19 (# V9880)、CYP2D6 (# V9890) D

通过与P450还原酶或P450还原酶加上细胞色素B5的昆虫细胞的膜制剂进行P450测定。对于背景测量,使用没有P450酶的膜级分。P450反应在不透明的96孔肋骨中进行®在KPO 4缓冲液中使用50μl体积(pH7.4)。将P450酶在37℃下用它们的基材温育10-30分钟。通过添加NADPH再生溶液引发反应。停止P450活性,通过添加荧光素检测试剂开始发光。在发光模式下直接在BMG Labtech微孔板读卡器上读取发光。德赢vwin官网客服仪器的孵化室和板载喷射器可以很容易地用于自动化该过程。每个数据点代表三个井的平均值。


成绩与讨论

使用BMG LABT德赢vwin官网客服ECH reader, P450- glo™检测已知的P450抑制剂对重组P450的剂量依赖性抑制。图3为CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4这五大药物代谢产物及其抑制剂的剂量相关抑制活性曲线。坚决的集成电路50数值与用常规探针衬底获得的数值相似。这一数据表明,单一化合物的浓度范围可以筛选来测量IC50值,但它也意味着单一浓度的多种测试化合物可以筛选化学库。

结论

P450-Glo™测定提供了一种快速,灵敏和高度可重复的P450筛选方法。该系统以自动化或手动多孔板格式的传统P450测定协议兼容。P450-GLO™发光测定有几种独特的特性:

  • 速度-发光反应是即时的,无需耗时的分析
  • 较大的敏感性 - 低背景水平和大的动态范围导致敏感的测定,需要较少的P450酶
  • 可溶性底物- P450-Glo™底物在水溶液中高度溶解
  • 单读出-多种P450亚型与多种底物可以在一个单一的仪器设置
  • 低假阳性率-专利稳定的萤火虫荧光素酶最大限度地减少假阳性的数量,由于荧光素酶抑制分析物时,筛选P450抑制剂

德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板读取器提供了执行Promega P450-Glo的完美平台TM化验。通过专用的发光检测系统,BMG LABTECH阅读器最大限度地减少了背景信号,从而增加了数据的可信度。德赢vwin官网客服此外,带有两个可选的板载注射器和一个标准的45°C孵育室,BMG LABTECH阅读器可以很容易地实现完全自动化,以执行所有的P450筛选需求。德赢vwin官网客服

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