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促进聚集作为评估抗体分子稳定性的手段

艾莉森•特纳 UCB(延展期间) 02/2011
  • 压力会引起抗体的变性和聚集
  • 使用基于荧光的96孔格式检测候选抗体的聚集倾向

介绍

在抗体分子的制造过程中,它们会受到泵送和过滤等过程产生的机械应力。这可能导致变性,并由于蛋白质暴露在空气-液体界面和剪切力而导致聚集,最终导致生物活性的丧失。因此,在候选选择过程中,关于抗体分子在不同缓冲条件下的聚集倾向的数据将有助于预测在生产过程中可能遇到的问题和保质期稳定性。振动应力是一种方便的方法来筛选和比较抗体在不同缓冲条件下的鲁棒性制造,并用于模拟应力在空气-液体界面的影响。


已经进行了实验,其中通过在1.5ml管中涡旋中涡旋和通过浊度变化测量的聚集程度(340nm / 595nm的吸光度)来压力进行实验。这涉及在各种时间点中除去等分试样,用于通过分光光度计进行手动分析,尽管该方法可用于筛选不同抗体候选物,但它不能容纳大量样品,并且数据收集效率低下。


需要较高的吞吐量(96孔板格式)筛选方法,这将允许在方便的分析窗口内连续实时测量聚集。


来自BMG LABTECH的基于过滤器的微孔板阅读器,配备了振动选项(允许线德赢vwin官网客服性、轨道和双轨道连续振动),在动力学模式下设置了吸光度和荧光检测,使我们能够探索一种更有效的方法来测量聚集倾向。


通过在线吸光度分析(340 nm/595 nm)判断,即使在7天的白天窗口,旋涡实验中使用的分子和条件最初转移到96孔格式证明是不成功的,导致聚合促进的变化微不足道。然而,在每孔中加入特氟隆珠会在24-48小时的时间窗内改变吸光度。特氟隆珠会对吸收信号造成干扰,因此聚集倾向的测量是通过加入原位荧光染料硫黄素T(一种苯并噻唑染料,当与纤维聚集物结合时,荧光增强)来监测的。

材料与方法

  • Teflon珠子(涤纶Teflon 1/8“直径,多肌气)
  • 黑色96孔微孔板,康宁
  • BMG Labtech基于滤光片的微孔板读卡器德赢vwin官网客服

实验1
抗体分子最终浓度为1 mg/mL,置于50 mM醋酸钠/125 mM氯化钠缓冲液(pH 5)中。在上述缓冲液中配制2.5 mM硫黄素T (ThT)储备液。


测试溶液如下组合:

  • 980μL抗体溶液+20μl缓冲液
  • 980 μL抗体溶液+ 20 μL硫黄溶液
  • 980μL缓冲液+20μL硫酰伐溶液。

在96孔的微孔板上,每孔取150 μL的试验溶液,无论是否有一个特氟龙珠。当实验在37°C下进行并延长时间时,使用板封剂来消除蒸发造成的样品损失。

仪器设置

不。周期: 44
周期: 1810秒
不。闪光/: 10
激励: 440-10
排放: 480 - 10
震动频率(rpm): 1100
摇动模式: 轨道
额外的震动时间: 温度:37℃。


实验2
5种不同的抗体分子在50 mM乙酸钠/ 125 mM氯化钠缓冲液(pH 5)中稀释至最终浓度为1 mg/mL。筛选5种不同抗体分子的仪器设置如实验1所述。


成绩与讨论

第一个实验是为了确定包合特氟隆珠是否能促进抗体分子的聚集(图1)。

当抗体样品在Teflon珠子存在下时,荧光强度只有增加。有人指出,整体荧光强度较高,其中存在硫蛋白T.但由于在实验期间存在而言,没有似乎没有聚集促进。


为了建立Teflon珠粒的作用,特别是原位硫蛋白T,通过动态光散射(DLS)分析抗体样品(数据未示出)。DLS数据示出了当蛋白质在Teflon珠子存在下时,只有产生大颗粒。当蛋白质在没有珠子的情况下摇动并且原位硫蛋白T.因此,在仅在Teflon珠子的存在下而不是由硫蛋白T.而不是通过硫蛋白T.而不是通过硫蛋白T.而不是由硫蛋白T.而不是由硫蛋白T.而不是旋转的颗粒形成时,没有颗粒形成。


第二个实验是为了筛选不同的抗体分子。该试验的目的是调查是否有可能区分5种不同的抗体分子与聚集倾向在一个设定的缓冲条件。结果如图2所示。

当检测五种不同的抗体分子时,可以根据它们在缓冲液中不同的聚集率来区分它们。可以计算出每种抗体分子不同的聚集率,并得到一个排序,见图3。排列顺序为Ab3 > Ab2 > Ab5 > Ab1=Ab4,其中A3在所选缓冲液中有最大的聚集倾向。

有趣的是,不同抗体分子的排列顺序与用另一种方法(涡流搅动——数据未显示)促进聚集所得到的顺序相同。


结论

BMG LabTech的基于滤光片的多竞选微孔板读卡器在初步实验中证明了作为合适的高通量筛选方法,用于评估不同德赢vwin官网客服抗体分子的聚集稳定性。


由于使用1.5ml管中的涡流读取器的涡旋读取器的振动选项的机械应力更平缓,因此需要包含Teflon珠粒。这用于引入更多的湍流,因此增加了对空气液体界面的暴露导致的促进聚集的速度更快和更有效。


目前正在进行进一步的研究,以评估不同缓冲液的使用情况,从而有助于制订前的工作。

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