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BMG Labtech微孔板读卡器上的蛋白质聚集监测德赢vwin官网客服

斯蒂芬潘罗伯特C.河流 剑桥化学大学 12/2005
  • 吸光度和荧光评估蛋白质聚集
  • 通过分子伴侣对温度诱导的蛋白质聚集的剂量依赖性抑制的评估
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH酶标仪非常适合于高通量蛋白聚集筛选

概括

蛋白质聚集是许多衰弱和往往是可治愈的人类疾病的原因。此外,药物制剂中的聚集总是导致减少疗效,低产量,储存能力差,增加的生产成本。在BMG Labtech上施加了两种测定德赢vwin官网客服微孔板读者评估蛋白质聚集。一个是基于增加的荧光强度硫蛋白T(THT)在结合β-片状的原纤维时;另一个基于沉淀蛋白诱导的浊度变化。

使用BMG La德赢vwin官网客服bTech多模式读取器,通过将样品加热至60℃并监测340nm的吸光度来确定野生型和突变蛋白质聚集的差异。使用THT终点测定确认这些差异。观察到野生型自聚集蛋白的高荧光,而一些突变形式得到低荧光信号。

我们证明,BMG Labtech酶标读者非常适合于德赢vwin官网客服中吞吐量的聚集性能,以及遵循蛋白质聚集的动力学。

介绍

蛋白质聚集是许多衰弱性和经常可治区疾病的潜在原因。此外,药物制剂中的聚集总是导致减少疗效,低产量,储存能力差,增加的生产成本。


理解为什么和蛋白质的能力无疑有助于改善目前旨在消除这种现象的原因和影响的现有策略。这可能听起来很容易,但现实是,诱导蛋白质聚集所需的条件通常是高度蛋白质特异性的,并且与蛋白质本身一样多种。


评估效果温度,pH,分子挤出,序列突变等的任务几乎是不可能的,如果不是坚定地建立的筛查技术,几乎是不可能的。


在本报告中,我们通过突出蛋白质聚集研究中的潜在用途的例子来探索BMG Labtech微孔板读者的一些功能。德赢vwin官网客服

这里呈现的结果是从最近的蛋白质的聚集研究获得,这是由于其固有的自聚集体形成原纤维,具有严重减少的治疗潜力。由于本研究的敏感性,应简单地称为“蛋白质X”。

材料与方法

1.通过吸光度和荧光评估蛋白质聚集

由于“蛋白质X”的野生型形式固有地易于聚集,因此我们设计了许多含有最小残留物取代的变体。使用BMG Labt德赢vwin官网客服ech微孔板读者,我们继续测试它们在希望找到合适的治疗值WT序列替代品的能力。通过“蛋白质X”和变体的时间依赖性聚集,然后测量与A340的沉淀蛋白形成相关的浊度。通过测量与染料的特异性结合,硫蛋白T(TH-T)相关的荧光来评估纤维聚集体的终点形成,富含β-片状的原纤维。


程序:

i)以1mg / ml的蛋白质浓度制备“蛋白质X”
II)根据需要有多少测试,加入100ml等分试样以分离96-或384孔微孔板的孔。
iii)将板插入BMG Labtech略微板读卡器,并按照所示德赢vwin官网客服调节仪器设置:

对于吸光度

波长: 340 nm.
测量。开始时间: 0秒
周期 7200秒
循环次数:30 30.
摇晃时间*: 300秒
震动: 轨道
温度: 37℃

对荧光

前任。滤波波长: 440海里
Em.滤光片波长: 480 nm.
温度: 25℃

iv)开始计划
*摇动样品将有助于促进蛋白质聚集并减少发生此事件的时间。

2.评估分子伴侣对温度诱导蛋白质聚集的剂量依赖性抑制作用

分子伴侣是具有稳定和预防部分展开蛋白质聚集的独特能力的蛋白质。在这里,我们说明了如何使用BMG Labtech微孔德赢vwin官网客服板读者来评估分子伴侣对“蛋白质X”聚集的抑制作用。作为“蛋白质X”是热不稳定的,我们选择通过在我们选择的伴侣的存在或不存在的情况下通过对蛋白质进行蛋白质至60°C来利用微孔板读取器的加热能力。


程序:

i)配制不同浓度的“蛋白X”、“伴侣蛋白X”或“蛋白X”溶液,然后分别加入酶标板孔中。
ii)将板插入预热的(60°C)BMG Labtech微孔板读卡器,并如图所示调整仪器设置:德赢vwin官网客服

波长: 340 nm.
测量。开始时间: 0秒
周期: 120秒
周期: 70
摇晃时间: 60秒
震动: 轨道
温度: 60°C

iii)运行时历程

成绩与讨论

图1显示了通过野生型“蛋白质X”及其变体的蛋白质聚集曲线图。在测试3的6个蛋白质中,3没有表现出任何可检测到的自我聚集倾向。

硫蛋白T结合研究表明,在6个样品的3个样品中存在纤维聚集体的存在高荧光;这些是相同的3个样品,其显示通过吸光度广泛聚集。

我们能够纳入从活动试验中获得的这些和其他数据,以最终表明变体2和4是进一步治疗相关研究的良好候选者。在存在或不存在分子伴侣的情况下,热诱导的“蛋白质X”聚集在图3中示出。


在60°C加热“蛋白X”会导致广泛的聚集,在20分钟时达到最大。在伴侣数量增加的情况下,聚集的速度和程度显著地、成比例地降低。这些结果清楚地表明,分子伴侣能抑制“Protein X”的聚集。

结论

我们已经证明,BMG LABTECH酶标仪非常适合中到高通量德赢vwin官网客服实验室,需要筛选大量实验条件。

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