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用BMG LABTECH酶标仪监测蛋白质聚集德赢vwin官网客服

斯蒂芬潘罗伯特C.河流 剑桥大学化学系 12/2005
  • 用吸光度和荧光法评估蛋白质聚集
  • 分子伴侣评估温度诱导蛋白质聚集的剂量依赖性抑制作用
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器非常适合高通量蛋白质聚集筛选

表的内容

总结

蛋白质聚集是许多使人衰弱、往往无法治愈的人类疾病的原因。此外,药物在配制过程中的聚集也会导致药效降低、产量低、储存能力差、生产成本增加。在BMG实验室技术上应用了两种分析方法德赢vwin官网客服标仪来评估蛋白质的聚集。一是基于增长荧光强度硫蛋白T(THT)在结合β-片状的原纤维时;另一个基于沉淀蛋白诱导的浊度变化。

使用BMG LA德赢vwin官网客服BTECH多模式解读器,通过将样品加热到60°C,并在340 nm处监测吸光度,确定野生型和突变蛋白聚集的差异。这些差异通过ThT终点分析得到证实。野生型自聚集蛋白的荧光强度高,而一些突变型自聚集蛋白的荧光强度低。

我们证明了BMG LABTECH微孔板阅读器非常适德赢vwin官网客服合筛选中到高通量的聚集特性,以及跟踪蛋白质聚集动力学。

介绍

蛋白质聚集是许多使人衰弱且常常无法治愈的人类疾病的根本原因。此外,药物在配制过程中的聚集也会导致药效降低、产量低、储存能力差、生产成本增加。


理解蛋白质聚集的原因和方式无疑将有助于改进目前旨在消除这种现象的原因和影响的策略。这听起来可能很容易,但事实是,诱导蛋白质聚集所需的条件往往具有高度的蛋白质特异性,而且就像蛋白质本身一样多种多样。


评估效果温度,pH,分子挤出,序列突变等的任务几乎是不可能的,如果不是坚定地建立的筛查技术,几乎是不可能的。


在本报告中,我们通过突出蛋白质聚集研究中的潜在用途的例子来探索BMG Labtech微孔板读者的一些功能。德赢vwin官网客服

本文的结果来自于最近对一种蛋白质的聚集研究,由于其固有的自聚集形成纤维的倾向,严重削弱了治疗潜力。由于本研究的敏感性,本报告中将其简称为“X蛋白”。

材料与方法

1.通过吸光度和荧光评估蛋白质聚集

由于“蛋白质X”的野生型形式固有地易于聚集,因此我们设计了许多含有最小残留物取代的变体。使用BMG Labt德赢vwin官网客服ech微孔板读者,我们继续测试它们在希望找到合适的治疗值WT序列替代品的能力。通过“蛋白质X”和变体的时间依赖性聚集,然后测量与A340的沉淀蛋白形成相关的浊度。通过测量与染料的特异性结合,硫蛋白T(TH-T)相关的荧光来评估纤维聚集体的终点形成,富含β-片状的原纤维。


程序:

i)制备蛋白X,蛋白浓度为1mg/mL
ii)根据需要多少次测试,向96孔或384孔孔板的孔中分别加入100毫升等量物。
iii)将板插入BMG Labtech略微板读卡器,并按照所示德赢vwin官网客服调节仪器设置:

对于吸光度

波长: 340 nm.
量。开始时间: 0秒
周期时间 7200年代
循环次数:30次 30.
摇晃时间*: 300年代
摇晃: 轨道
温度: 37°C

对于荧光

例如波长过滤: 440 nm.
他们。滤波波长: 480海里
温度: 25°C

(四)开始计划
*摇动样品将有助于促进蛋白质聚集并减少发生此事件的时间。

2.分子伴侣评估温度诱导蛋白质聚集的剂量依赖性抑制作用

分子伴侣是一种具有稳定和阻止部分未展开蛋白质聚集的独特能力的蛋白质。在这里,我们演示了如何使用BMG LABTECH的微德赢vwin官网客服孔板阅读器来评估分子伴侣对“蛋白X”聚集的抑制作用。由于“蛋白质X”是热不稳定的,我们选择利用酶标阅读器的加热能力,将蛋白质置于60°C,无论是否存在我们所选择的伴侣。


程序:

i)单独制备“蛋白质X”的溶液,单独的伴侣,或“蛋白质X”,具有不同浓度的伴侣,然后将它们加入到微孔板的单独孔中。
ii)将板插入预热的(60°C)BMG Labtech微孔板读卡器,并如图所示调整仪器设置:德赢vwin官网客服

波长: 340 nm.
量。开始时间: 0秒
周期时间: 120秒
周期数: 70
摇晃时间: 60秒
摇晃: 轨道
温度: 60℃

iii)运行时间课程

结果与讨论

图1显示了野生型“X蛋白”及其变种的蛋白质聚集图。在检测的6种蛋白质中,有3种没有表现出任何可检测到的自聚集倾向。

硫黄素T结合研究表明,6个样品中有3个存在纤维聚集物,荧光强度高;这是同样的3个样品在吸光度下表现出大量聚集。

我们能够整合这些和其他从活动测试中获得的数据,最终表明变量2和4是进一步治疗相关研究的良好候选。在有或没有分子伴侣的情况下,热诱导的“蛋白X”聚集的时间过程如图3所示。


在60℃下加热“蛋白质X”导致广泛的聚集,最大达到20分钟。在增加伴侣的增加的情况下,聚集的速率和程度显着和成比例降低。这些结果清楚地表明分子伴侣可以抑制“蛋白质X”的聚集。

结论

我们已经证明,BMG Labtech酶标读卡器非常适合中到高德赢vwin官网客服通量实验室,其中需要筛选大型的实验条件。

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