312

蛋白质诱导荧光增强检测微孔板中蛋白质-核酸的相互作用

Fulneček J. Valuchová S. Petrov A.P. Tripsianes K. Říha K. 捷克布尔诺马萨里克大学中欧理工学院植物分子生物学研究组 10/2017
  • 检测蛋白-的结构和序列特异性DNA的相互作用
  • BMG LABTECH的多模式阅读器的良好扫描功能,德赢vwin官网客服用于增加测量表面和稳定性

表的内容

总结

各种生物学过程都依赖于蛋白质与核酸的相互作用。这些包括转录调控、DNA复制和DNA修复。传统的研究相互作用的方法要么是费力的(EMSA, ChIP),要么是局限于特定的靶点(EMSA, FP, ChIP)。


一种新的检测方法使用Cy3荧光团,当接近蛋白质时增加其荧光:Cy3标记的寡核苷酸固定在微孔板底部,在微孔板阅读器上测量基底荧光。如果一个蛋白质被添加到与寡核苷酸结合的微孔板孔中,荧光团的荧光就会增加。这种增加可以测量和报告蛋白质-核酸结合。


这种简单而经济有效的检测方法检测序列和结构的特异性以及核酸的结合常数:蛋白质连接。的变化荧光强度在一个巨大的表面上捕获,提供稳定的测量。这是由井扫描功能和高灵敏度的FLUOstar®ω

介绍

各种生物学过程都依赖于蛋白质与核酸的相互作用。这包括DNA的包装、转录调控、DNA复制和DNA修复。迄今为止,蛋白质与核酸的结合可以通过电泳迁移率漂移分析(EMSAs)、荧光偏振分析(FP)或染色质免疫沉淀(ChIP)来检测。然而,这些方法要么是费力的(EMSA, ChIP),要么是局限于特定的目标(EMSA, FP, ChIP)。一种新的荧光检测方法检测核酸与蛋白质的相互作用,以确定结合、序列和结构特异性或解离常数。微孔板法是一种快速和经济的替代方法,可以在荧光阅读器上读取,具有扫描孔的能力,如荧光星®ω。

测定原理

菁染料根据其所处的环境表现为非荧光的顺式异构体和荧光的反式异构体1。微孔蛋白诱导荧光增强(mwpfe)检测利用了这种现象,因为它使用cy3结合的低聚物固定在微孔板底部。接近Cy-3的蛋白质结合在空间上阻碍了非荧光顺式异构体的形成,导致荧光增强(图1A)。pfe值的计算流程如图1B和C所示。


材料与方法

  • 黑色96孔微孔板(Greiner, flutracTM600,高结合,#655077)涂以100µl NeutrAvidin (Pierce,结合能力~15pmol D-biotin/well),并使用SuperBlock block blocking buffer (ThermoScientific, #15117)阻塞
  • 蛋白*:BamHI (ThermoScientifi c), XPF/ERCC1(在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达),KU70/KU80(在昆虫细胞HI5中表达)
  • Cy3-labeled寡核苷酸(IDT) *
  • 氟星Omega微孔板读卡器德赢vwin官网客服

将cy3标记的寡核苷酸(100 μl, 25nM)在平板上孵育2 h进行结合,随后洗涤3次以去除残留的核酸。第一次扫描测定基线荧光,第二次扫描检测蛋白与100 μl蛋白溶液孵育后的寡核苷酸结合。


仪器的设置

FLUOstarω
光学设置 荧光强度,井扫描方式,顶部光
激励: Ex540-10
排放: Em580-10
获得: 2000
一般设置 解决时间: 0.1秒
每个扫描点闪烁次数: 10
扫描设置 矩阵
扫描点: 10 x 10
直径: 6毫米

结果与讨论

利用微孔板上的蛋白诱导荧光增强,核酸内切酶BamHI与其识别位点的结合被pfe -值验证为30%(图2B)。加入含有识别位点的非标记寡核苷酸,但识别基序之外的序列改变使pfe值下降到5- 15%,这取决于浓度和序列。这表明bamhi与cy3标记的oligo的结合较低,这是由于与未标记的oligo的竞争性结合。识别位点内带有突变的非标记探针的pfe -值为> 30%,表示BamHI与野生型识别位点的无干扰结合。

mwpfe检测蛋白质-DNA结合的序列倾向性,研究了蛋白质与特定DNA结构的优先结合。XPF/ERCC1异源二聚体切割受损DNA进行修复,并特异性结合受损DNA的结构。一个保留dna结合位点的截短XPF/ERCC1异质二聚体用于确定结构特异性相互作用。二聚体最低限度结合的ssDNA或与探针竞争的短钝端DNA如图3B所示。由于竞争性dna结构的结合,pfe -值降低,观察到10 nt 3’悬垂,一个发夹和一个张开的dna结构(图3)。

KU70/KU80异源二聚体负责结合断裂的dsDNA端,从而保护它们不被降解,并使两端保持接近,以便结扎。增加ku -异源二聚体的浓度导致更高的pfe值,并允许测定平衡常数KD(图4)。

结论

mwpfe检测核酸与蛋白质的相互作用,并报告序列和结构特异性以及结合常数。荧光强度的变化需要在井的巨大表面捕获,以提供稳定的测量。这是由fluosstar Omega的井扫描功能及其高灵敏度实现的。这个简单且经济有效的分析扩展了应用程序,以检测特定于结构的绑定。它的平板形式加速了蛋白质-核酸相互作用的测定

参考文献

1.Hwang H. (2014) Chem Soc Rev. 43(4): 1221-1229
2.瓦卢乔瓦(2016)Sci代表23;6:39653。

*更多信息和使用mwpfe发布数据时,请参考Valuchova等人。2

去前