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Quant-It Picogreen DSDNA测定用于核酸定量

西尔克安吉斯巴赫罗恩厄普马克Gröne弗兰卡毛雷尔 德赢vwin官网客服 12/2014
  • 双链DNA量化使用LVIS板在下降至2μL
  • 宽阔的DNA范围内的高线性和敏感性
  • 易于使用紫外吸收替代分析,可以小型化和适应高通量系统

表的内容

介绍

核酸样品的定量是任何遗传和分子生物学实验室的主要需求。除了众所周知的紫外吸收测定法(如260/ 280nm),还有许多不同的基于荧光强度的DNA定量测定法。这些分析方法不仅比吸光度法更敏感,而且能够区分双链和单链DNA,以及RNA。


除了灵敏度和特定城市,对非常低的体积测量的需求正在出现。这是对测定以及检测仪器的具有挑战性。在本申请中,我们呈现在低容量LVIS板上获得的DNA量化数据,以及96-和384孔微孔板。


材料与方法

  • Quant-iT™PicoGreen®dsDNA化验,LifeTechnologies
  • 低批量旱冰板,BMG Labtech德赢vwin官网客服
  • 黑色96孔和384孔微孔板,Greiner

样品制备
试剂盒提供所有必需的试剂,如检测试剂,TE缓冲液,DNA标准(Lambda DNA标准)。从20X TE缓冲液中,使用HPLC级水制备1X TE缓冲液。picogreen®使用1x TE缓冲液将试剂稀释1:200。用1x TE缓冲液稀释DSDNA标准物,得到2至1000ng / ml的浓度范围。DNA标准被移去6重复,加入相同数量的Picogreen®试剂进入每个孔,导致Fi nal体积:200μl在96孔板中,在384孔板中为20μl,在LVIS板中为2μL。空白由TE缓冲液组成。

仪器设置

Flyostar / Polartar Omega Clariostar. PHERAstarFS.
过滤器设置 ex485.
EM520
ex485.
EM520
光学模块:
FI 485 520.
单色仪的设置 例:483 - 14所示
EM:530-30

所有其他设置都是FORespent Endpoint测试协议的默认设置。

成绩与讨论

PicoGreen的荧光扫描®试剂与DNA结合
为了确定Clariostar的有用单色器设置,为DNA绑定的Picogreen进行了激励和发射扫描®试剂光谱扫描结果如图1所示。

扫描显示在502nm处的激发最大值和524nm的发射最大值。为了进一步测量,通过改变用于激发和发射的带宽来确定最高信号/空白比率。

96年好

在96孔板中,使用滤波器或单色仪得到的标准曲线非常相似(图2)。使用滤波器时,标准曲线的斜率略高。

384年好
小型化测定,井体积降至20μL。在384-孔小体积板(图3)中得到的标准曲线与96孔板的数据相当。

使用滤光器(R.)为Clariostar实现了非常好的线性度(R.2= 0.9999)或LVF Mono-Chromators™(R2= 0.9998)。


LVis板结果
利用LVIS板,可以进一步小型化测定。这种特殊板开发用于使用少至2μL的体积。

最初开发用来做DNA和蛋白质紫外吸收定量的LVis平板,用在CLARIOstar或pherstar上FS.,是一种优异的工具,用于确定在流荧光强度模式下样品的DNA含量。Picogreen的结果®在LVIS板中的测定如图4所示。4。

结论

标准曲线数据显示皮科格伦®该方法在较宽的DNA浓度范围内具有良好的线性和灵敏度。对于CLARIOstar, LVF mono色谱仪™表现出滤光片般的性能。例如,对滤光片和LVF单色器™,384孔板的灵敏度计算为约3 pg/孔。


在Picogreen的帮助下®测定,在96-和384孔板中的LVIS板中的任何优选体积,2μl或标准体积,可用于确定样品的DNA浓度。

Picogreen是Invitrogen的注册商标。

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