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用荧光染料量化双链DNA:Hoechst 33258在Fluostar Omega上测量

MarcoGöttig(1)andrea krumm(2)Rabea Meyberg(1)克里斯蒂安K. Ullrich(1)Stefan A. rensing(1) (1)植物细胞生物学,生物学院,马尔堡大学(2)BMG Labtech GmbH德赢vwin官网客服 08/2018
  • 使用Hoechst 33258 DSDNA染料在微孔板读卡器中进行成本效用EFIEICE DNA定量
  • 标准和准确测量DSDNA的量为例如对于NGS应用程序
  • flyostar.®Omega提供可靠,HTS兼容和自动检测平台

介绍

脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的储存介质,使其成为基础研究和诊断的主要主题。如今,所谓的下一代测序(NGS)方法在小时内并以合理的成本揭示基本序列和突变。可靠测序数据的先决条件是DNA文库的准确制备和定量。荧光DSDNA染料经常用于量化DSDNA,因为它们提供高灵敏度和特定城市。各种染料可在光谱特性,DNA结合模式,序列偏好,可检测的浓度范围和成本中不同。因此,需要仔细考虑用于特定DNA样品的染料。


在这里,我们在场DNA量化通过成本效益的Hoechst 33258 DNA结合FlOrophore。它在Flyostar上的检测®Omega导致线性程度高,精度测量11-300 ng /孔DSDNA。


测定原则

Hoechst 33258是一种双苯并酰亚胺,当与DSDNA结合时,具有急剧增加的流动性强度(图1)。该分子与DNA的次槽结合,优先于富有的区域(1)。

材料与方法

  • 黑色96好板(Greiner#655076)
  • flyostar.®欧米茄,B德赢vwin官网客服MG Labtech.
  • Hoechst 33258(ATT Bioquest#17520,Ultra Pure等级,供应商:Biomol)
  • Lambda Phage DNA(Thermofisher#SD0011,CONC。0.3μg/μl)

实验程序
将Lambda phage dsdna溶于水中。将Hoechst 33258稀释至1或0.1μg/ ml的TNE缓冲液(10mM Tris HCl 7.4; 200mM NaCl; 1mM EDTA),将199μl置于微孔板的孔中。向染料中加入一个微升DNA样品(5-300ng /μl),得到每孔200μl测量体积。标准测量一式三份完成。在彻底混合时(涡流,移液),使用FLUOSTAR OMEGA获取FOORESPET强度,下面的设置。


仪器设置

视镜设置 荧光强度,顶视音
过滤器 追税:355.
排放460.
在阅读之前调整了收益
通用设置 安定时间:0.5s
20井闪烁

成绩与讨论

Hoechst 33258 DNA定量方法的性能以两个Hoechst浓度进行测试:0.1μg/ ml和1μg/ ml。


在0.1μg/ ml的较低的Hoechst浓度下,双链λDNA的浓度最高为高达100ng(图2)。使用标准曲线的线性回归的斜率和15个坯料的平均值(无DNA)的平均值测定检测极限(LOD):LOD = 3xSD /斜率。计算LOD以每孔为11ng DSDNA,并且FORESPENT强度与DNA浓度之间的相关性高度线性,如r20.999。三份酸盐之间的%CV为<4.5%,表明稳定的测量值。然而,对于高DNA浓度(> 100ng /μl),荧光信号F1速溶于荧光信号F1,最有可能是由于流荧光DNA染料的饱和度。

为了延长Hoechst 33258可用于量化DSDNA的浓度范围,测试了更高的染料浓度。具有1μg/ mL的Hoechst染料浓度为1μg可检测的DNA浓度为32.5ng。将高流量浓度与低Hoechst浓度进行比较时的较高床位通过以1μg/ mL的Hoechst浓度测量的更高的坯料来解释。然而,增加了Hoechst浓度,以测量DSDNA> 100ng /孔。测量值为300ng /孔,最高浓度测试。

结论

使用FLOOSTERG Hoechst 33258 DSDNA染色与Fluostar Omega一起使用多模微孔板读卡器BMG德赢vwin官网客服 Labtech允许成本效益和特定的DSDNA样品的效果和特定的DSDNA样品/孔。该方法与高吞吐量兼容,当将微孔板读取器集成到液体处理系统时,可以全自动化。

Hoechst集中 最佳范围 样品浓度范围
(输入1μl)
0.1μg/ ml 11-100 ng /井
R.2= 0.9998.
11-100 ng /μl
1μg/ ml > 50 - min
300 ng /井
R.2= 0.9993.
> 50-300ng /μl

参考资料

1.Pjura Pe,Grzeskowiak K,Dickerson Re。(1987)Hoechst 33258的结合到B-DNA的次要凹槽中。J Mol Biol。1987年9月20日; 197(2):257-71。

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