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用荧光染料量化双链DNA:Hoechst 33258在Fluostar Omega上测量

Marco Göttig (1) Andrea Krumm (2) Rabea Meyberg (1) Kristian K. Ullrich (1) Stefan A. Rensing (1) (1)植物细胞生物学,生物学院,马尔堡大学(2)BMG Labtech GmbH德赢vwin官网客服 08/2018
  • 采用Hoechst 33258 dsDNA染料进行酶标仪DNA定量
  • 具体和准确的测量dsDNA的数量,例如用于NGS应用
  • FLUOstar®欧米茄提供了一个可靠的,兼容高温超导和自动化检测平台

介绍

脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的存储介质,是基础研究和诊断的重要课题。如今,所谓的下一代测序(NGS)方法可以在数小时内以合理的成本发现碱基序列和突变。准确制备和定量DNA文库是获得可靠测序数据的先决条件。荧光双链dna染料具有较高的灵敏度和特异性,常被用于定量双链dna。各种不同的染料在光谱性质、dna结合模式、序列偏好、可检测浓度范围和成本上都有差异。因此,特定DNA样本的染料需要仔细考虑。


在这里,我们现在DNA量化采用高性价比的Hoechst 33258 DNA结合荧光团。它是在氟星上检测到的®Omega导致线性程度高,精度测量11-300 ng /孔DSDNA。


测定原则

Hoechst 33258是一种双苯并酰亚胺,当与DSDNA结合时,具有急剧增加的流动性强度(图1)。该分子与DNA的次槽结合,优先于富有的区域(1)。

材料与方法

  • 黑色96孔板(Greiner #655076)
  • FLUOstar®ω, 德赢vwin官网客服BMG LABTECH
  • Hoechst 33258 (ATT Bioquest #17520,超纯级,供应商:Biomol)
  • Lambda Phage DNA(Thermofisher#SD0011,CONC。0.3μg/μl)

实验的程序
噬菌体dsDNA在水中溶解。Hoechst 33258被稀释成1或0.1µg/ml的TNE缓冲液(10 mM TRIS HCl pH 7.4;200毫米氯化钠;1 mM EDTA)和199µl置于酶切板孔中。在染料中加入1微升DNA样本(5-300 ng/µl),每孔测定量为200µl。标准测量一式三份。在彻底混合(涡旋、移液)后,使用FLUOstar Omega获取荧光强度,设置如下。


仪器的设置

光学设置 荧光强度,顶视音
过滤器 激励:355
460年发射
在阅读之前调整了收益
一般设置 结算时间:0.5秒
20井闪烁

成绩与讨论

用0.1µg/ml和1µg/ml的Hoechst 33258 dna定量法进行了性能测试。


在0.1μg/ ml的较低的Hoechst浓度下,双链λDNA的浓度最高为高达100ng(图2)。使用标准曲线的线性回归的斜率和15个坯料的平均值(无DNA)的平均值测定检测极限(LOD):LOD = 3xSD /斜率。计算LOD以每孔为11ng DSDNA,并且FORESPENT强度与DNA浓度之间的相关性高度线性,如r20.999。三次重复之间的% CV < 4.5%,表明测量结果稳定。然而,在高DNA浓度(>100ng/µl)时,荧光信号变平,这可能是由于荧光DNA染料饱和所致。

为了延长Hoechst 33258可用于量化DSDNA的浓度范围,测试了更高的染料浓度。具有1μg/ mL的Hoechst染料浓度为1μg可检测的DNA浓度为32.5ng。将高流量浓度与低Hoechst浓度进行比较时的较高床位通过以1μg/ mL的Hoechst浓度测量的更高的坯料来解释。然而,增加了Hoechst浓度,以测量DSDNA> 100ng /孔。测量值为300ng /孔,最高浓度测试。

结论

采用荧光Hoechst 33258 dsDNA与FLUOstar Omega一起染色多模标通过B德赢vwin官网客服MG LABTECH,可以对1-300µg/井的dsDNA样本进行成本效益和特异性的定量。该方法与高通量兼容,当将酶标仪集成到液体处理系统时,可以完全自动化。

Hoechst集中 最佳射程 样品浓度范围
(输入1µl)
0.1µg / ml 11-100 ng /井
R.2= 0.9998.
11 - 100 ng /µl
1µg / ml > 50 -分钟
300 ng /井
R.2= 0.9993.
>50 - 300 ng/µl

参考

1.Pjura PE, Grzeskowiak K, Dickerson RE. (1987) Hoechst 33258 Binding to the minor groove of B-DNA。中国生物医学工程学报,1999,20(2):257-71。

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