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使用PHERAstar FS - HTS的一种新格式,定量荧光配体与活细胞中的GPCRs结合

艾莉森·卡特(1)凯文·汤普森(1)凯瑟琳·沃克(2) (1)Cellaura Technologies(2)BMG德赢vwin官网客服 Labtech 06/2012
  • 使用Pherastar测量的活细胞中与GPCR结合的荧光配体®FS
  • 未标记的竞争对手置换IC50.在96口井格式下,每盘作业时间< 3分钟
  • 快速替代高含量分析的受体结合和筛选

表的内容

介绍

在g蛋白偶联受体(GPCRs)上的配体结合亲和力历史上一直被测定为使用放射性配体与未标记药物样化合物竞争受体结合位点。然而,开源放射性同位素处理的潜在危险以及放射性同位素处理对环境的影响,使其成为一项不太理想且成本高昂的技术。GPCRs荧光配体的发展为测定配体结合亲和力提供了一种更安全的方法。然而,荧光配体结合的定量往往依赖于高分辨率的荧光图像捕获。这种方法可能是冗长而乏味的,导致96孔板的读取时间大约为30分钟或更长(取决于每孔的图像数量)。复杂的捕捉后图像分析算法也延长了数据处理时间。这导致了高含量分析(HCA)检测太慢,不能用于高通量筛选(HTS)。

在这项研究中,我们使用了可调焦距特征和先进的底部读数的pherstarFS从BMG LabTech的板读数器,德赢vwin官网客服在活细胞96孔板的基础测定中,以量化与孔底部的粘附细胞层相关的荧光配体结合。实时,多点荧光强度测量和平均每孔,并入较为坯料减法和样品位移曲线计算,随着孔的分析,执行“在飞行”中。根据井扫描区域,灯数闪烁,并且分析的每次斑点数量,这导致了全包96孔板“读到IC50.PKI曲线绘图'2.5到10分钟的时间。这与HCA测定鲜明对比,这可能需要大约60分钟才能实现相同的端点。


在这项研究中,我们说明PHERAstar的能力FS用CellAura的两种荧光配体进行腺苷和多巴胺受体的荧光配体结合试验。此外,我们假设这种平板阅读器和荧光配体的组合适合于更高通量受体结合试验和筛选。

材料与方法

这些实验中使用的两种荧光配体是由CellAura科技有限公司开发的。配体CA200645是一种腺苷A3选择性配体,CA200767是一种多巴胺D1选择性配体。两种配体都用BODIPY 630/650荧光团标记,该荧光团在光谱的远红端发出荧光。


a1 -选择性拮抗剂DPCPX和a3 -选择性拮抗剂MRS1220均来自Tocris。d1选择性拮抗剂SCH23390来自Sigma-Aldrich。黑面,透明底,96孔视图板来自Greiner Bio-One。


Pherastar.FS安装了一个用于BODIPY 630/650的光模块,以提供620 nm的激励和660 nm的发射测量。

实验

表达人腺苷A1或A3受体或多巴胺D1受体的CHO细胞在T75烧瓶中汇集,收获并播种成96孔黑色视板,并在37℃下孵育5%CO2检测前24小时。在试验当天,抽吸培养液,并在1.2x终浓度下,用100 μL无血清培养基替换,有或没有适当的未标记竞争物。细胞在37℃,5% CO下孵育30分钟2。将荧光配体在6倍终浓度下加入20μl体积(以1:6稀释)中加入适当的孔。将细胞在37℃下在37℃下孵育30分钟,5%CO2。将细胞在HBS中洗涤两次以除去未结合的配体,用最终100μl体积的HBS加入到所有孔中。


“pherstar”上有铭牌FS在底部读取模式使用620/660 nm光模块。选择一个5x5点读取矩阵,从每口井的直径为4mm处读取(减小直径消除了井的边缘以及该区域细胞分布的任何异常)。在读取平板之前,进行z -高度扫描,以确定定量荧光结合到孔底部细胞层的最佳高度。自动增益调整也被执行,以给出最佳增益为3300。用上述设置进行测量,每个板的读取时间为2.5分钟是可能的。

结果与讨论

BODIPY 630/650标记的荧光配体与它们的目标受体结合,并使用PHERAstar检测FS。使用阳性对照(荧光配体无标记竞争者)和阴性对照(无荧光配体)之间的平均荧光强度差异来计算测定的稳健性Z’因子。荧光配体的结合被适当的未标记竞争物取代。配体-受体组合的pKi如下所示。


xac衍生物腺苷A3受体拮抗剂CA200645与人腺苷A3受体结合,Z ' -因子为0.62±0.07(平均值±SEM, n=6)。腺苷A3选择性拮抗剂MRS1220取代了荧光配体CA200645,其pKi值为8.58±0.12 (n=5)(图1)。这个值与报道的在腺苷A3受体8.76处MRS1220的pKi值相似,该值是通过放射配体结合试验测定的。

A3受体拮抗剂CA200645与腺苷A1受体的亲和力较低,Z’-因子为0.61±0.1 (n=5)。A1选择性拮抗剂DPCPX能够取代a3选择性荧光配体,得到的pKi为7.47±0.10 (n=4)(图2)。报道的DPCPX在腺苷A1受体上的pKi为8.41。

SKF-83566-衍生物多巴胺D1受体拮抗剂Ca200767,得到0.40±0.13(n = 3)。D1选择性拮抗剂SCH23390移位荧光D1配体,得到8.63±0.03(n = 3)的PKI(图3)。在多巴胺D1受体的该配体的报道PKI在9.3和9.7之间。

结论

这些数据说明了pherstar的能力FS使用简单的“add > mix > wash > read”检测方案,快速、可靠地定量荧光配体与96孔格式表达重组人GPCRs的活细胞的结合,类似于全细胞放射配体结合检测,但具有固有的安全性和成本优势。它还提供了相当多的读取和分析时间节省的优势,比HCA分析,潜在地使这种格式适合高通量筛选(HTS)。除了显示的数据,CellAura还使用了pherstarFS将他们的BODIPY 630/650配体结合试验与其他荧光团,如Hoechst或DAPI,以正常化细胞数量。它也可能被证明可以测量下游的第二信使激活,例如使用相同的细胞来测量Ca++,从而为实验数据增加更多的价值。

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