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定量,高通量,基于荧光的生物测定法检测血吸虫的活力

Emily Peak Iain W. Chalmers Karl F. Hoffmann Aberystwyth大学 03/2011
  • 病原体震动的保守检测血吸虫涉及低吞吐量显微镜
  • 两种荧光团用作指标血吸虫可行性
  • 在BMG Labtech的基于滤光片的微孔板读卡器上进行了双彩色荧光测量德赢vwin官网客服

介绍

血液侥幸血吸虫是一个寄生虫,每年负责超过20万人死亡。要检测的艺术状态血吸虫活力涉及显微镜和对寄生虫形态的了解。缺乏量化的适当方法血吸虫生存能力阻止了新的Anthelmintics的发展。

在本申请中,我们介绍了一种基于荧光强度的微量滴定板测定以可重复地检测血吸虫活力。测定原理基于染料的差膜渗透率,荧光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙啶(PI)。荧光素二酸能够穿过活细胞的膜。一旦细胞内,酯酶将切割酸糖酸盐,荧光素被释放,导致可测量的荧光信号与活细胞的数量直接相关。相反,碘化丙啶不能进入活细胞。当膜受到损害时,该染料将仅染色死细胞的DNA。同时检测碘化钛和荧光素二乙酸酯的措施使我们能够开发荧光的微孔板生物测定,以改善血吸虫活力的检测。使用这种柔性生物测定法,我们证明了在响应于硫氧吡喃糖酰硫酰硫磷酸酯还原酶(Auranofin)的已知抑制剂中检测血吸虫活力的通用性。

材料与方法

  • 来自FisherScientificific的黑白,清晰,平坦的96孔板
  • 黑色,清澈,透明,底部的384孔板,来自矩阵

Schistosomula制备和培养
血吸虫被感染的蜗牛暴露在光线上。蜗牛脱落的鞘膜植物通过机械转换随后转化为血吸虫管。纯化后,进行微观检查以评估纯化的血吸虫的数量和质量。制备后,将血吸虫在烧瓶中培养24小时,并等待成96孔板(每200μL1000寄生虫)或384孔板(每40μL200寄生虫)。


血吸虫病的活力测定响应auranofin
在37℃和5%Co的酚醛红外DMEM中培养纯化的Schistosomula。2在不同浓度(10-0-625μm)的氨anofin存在。在此之后,将所有血吸虫调用三次以除去测试化合物和培养基补充剂。洗涤寄生虫后,同时向每个孔中同时加入碘化丙啶和荧光素二乙酸酯,以分别获得终浓度为2μg/ ml和0.5μg/ ml。


BMG Labtech酶读卡器中的测量德赢vwin官网客服

用544nm激发/ 620nm发射从底部测量样品以检测PI和485nm激发/ 520nm发射以检测FDA。
通过在37℃下设定的板读取器培养箱获得所有荧光值,以确保荧光素二酸的有效酯酶转化为Live Schistosomula内的荧光素。包含适当的对照样品(活和热杀死的死血吸虫)补偿任何板间变化。

数据处理
使用以下等式计算每个孔中的活生和死血吸虫的数量:

  • 活(FDA荧光)=(F样本- Fneg.contr。) / (Fpos.contr。- Fneg.contr.
  • 死(pi荧光)=(f样本- F媒体控制) / (Fneg.contr。- F媒体控制

F =荧光强度单位

样品=与测试化合物温育的寄生虫

阴性对照=寄生虫被热冲击杀死

阳性对照=未经治疗的寄生虫

媒体控制=仅包含媒体和没有寄生虫的井

Schistosomula的活力计算:

成绩与讨论

借助荧光显微镜,我们可以确认FDA对活细胞的染色是有用的,并且PI对于死细胞的染色是有用的。我们还可以证实,在单个血吸虫的同一细胞中没有观察到FDA或PI偏移的荧光的共定位。


最佳荧光团/ Schistosomula孵化时间
在预测试中,已经研究了两种染料应该与寄生虫一起孵育多长时间,以获得最大可重复的存活数据。结果如图1和2所示。

随着预期的死寄生虫,显示最高的PI发射值,而活寄生虫的信号靠近介质控制并随着时间的推移保持恒定。含有活生和死血吸虫的混合样品的值在内。我们选择了20分钟的孵育时间来收集PI数据,因为它提供了一个适当的时间窗口来处理多个微量滴定板(1中的*)。虽然死血吸虫的PI染色导致至少120分钟的发射增加,FDA染色显示出不同的结果(图2)。

生活,死亡和混合血吸虫群体产生了快速达到平台的排放数据(96孔板51分钟)。正如预期的那样,Live Schistosomula的排放值最高,对于死亡最低,而且对于混合群体,我们获得中间值。最佳FDA孵育时间计算为3至12分钟。我们选择5分钟来收集FDA数据(图2中的标记)。

Schistosomula的可行性响应Auranofin
为了验证测定,在寄生虫生长期间将测定,实验性TGR抑制剂和抗血吸虫化合物加入到寄生虫中。对血吸虫的可行性有一个明显和可滴定的抗血小面型效应(图3)

百分比可变性转化为探测值,也允许Auranofin LD50计算(0.82±0.49μm)。在10μm葵蛋白中看到的最大药物效果,其中微观检查Schistosomula证实死亡为100%。


结论

在本申请中,我们证明了一种可重复测量血吸虫的可行性的定量,快速和廉价的方法。使用双染色方法对于抵消任何移液误差是重要的,并且为了验证荧光的差异是真正因死亡率的差异而引起的。

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