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定量,高通量,基于荧光的生物测定法检测血吸虫的活力

Emily Peak Iain W. Chalmers Karl F. Hoffmann 阿伯雷斯威斯大学即 03/2011
  • 致病性吸虫的保守检测裂体吸虫属包括低通量显微镜
  • 作为指标的两个荧光团裂体吸虫属生存能力
  • 在BMG LABTECH的基于过滤器的微孔板阅读器上进行双色荧光测量德赢vwin官网客服

表的内容

介绍

血爪裂体吸虫属是一种寄生吸虫,每年造成20多万人死亡。最先进的检测技术裂体吸虫属生存能力包括显微镜和寄生虫形态学的知识。缺乏适当的量化方法裂体吸虫属生存能力阻止了新的Anthelmintics的发展。

在本应用笔记中,我们提出了一种基于荧光强度的微量滴度平板法,可重复检测血吸虫生存能力。测定的原理是基于染料、二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)的不同膜透性。二乙酸荧光素能够穿过活细胞的细胞膜。一旦进入细胞内,酯酶会切断二乙酸,荧光素释放,产生可测量的荧光信号,这与活细胞的数量直接相关。相反,碘化丙啶不能进入活细胞。这种染料只会在细胞膜被破坏时染色死亡细胞的DNA。碘化丙啶和双乙酸荧光素同时检测,使我们能够开发基于荧光的微孔板生物测定法,以提高对血吸虫生存能力的检测。使用这种灵活的生物测定法,我们证明了它的通用性,在检测对已知的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(auranofin)抑制剂反应的血吸虫生存能力。

材料与方法

  • 来自FisherScientific公司的96孔黑壁透明平底板
  • 黑壁,透明和底部384孔板从矩阵

血吸虫的制备与培养
裂体吸虫属受感染的蜗牛暴露在阳光下。钉螺排出尾蚴后,通过机械转化转化为血吸虫。纯化后,用显微镜观察纯化的血吸虫数量和质量。制备后置于瓶中培养24h,分别置于96孔板(1000只/ 200 μL)和384孔板(200只/ 40 μL)中。


娥诺芬对血吸虫生存力的影响
纯化后的血吸虫置于无酚红DMEM的微孔板中,37℃和5% CO培养24小时2存在不同浓度(10- 0.625 μM)的劳诺芬。在此之后,所有的血吸虫被清洗三次,以去除试验化合物和培养基补充物。洗净后,每孔同时加入碘化丙啶和双乙酸荧光素,最终浓度分别为2 μg/mL和0.5 μg/mL。


BMG Labtech酶读卡器中的测量德赢vwin官网客服

用544nm激发/ 620nm发射从底部测量样品以检测PI和485nm激发/ 520nm发射以检测FDA。
所有荧光值均在设置为37°C的平板阅读培养箱中获得,以确保双乙酸荧光素在活血吸虫体内有效的酯酶转化为荧光素。包括适当的对照样本(活的和热致死的死的血吸虫)补偿任何板间的变化。

数据处理
每口井中活的和死的血吸虫数用下列公式计算:

  • 活(FDA荧光)=(F样本- Fneg.contr。) / (Fpos.contr。- Fneg.contr)
  • 死(荧光)= (F样本- F媒体控制) / (Fneg.contr。- F媒体控制)

F =荧光强度单位

样品=与测试化合物孵育的寄生虫

阴性对照=寄生虫被热冲击杀死

阳性对照=未经治疗的寄生虫

介质控制=只含介质而不含寄生虫的井

Schistosomula的活力计算:

结果与讨论

在荧光显微镜的帮助下,我们可以确认FDA对活细胞染色有用,PI对死细胞染色有用。我们还可以确认,在单个血吸虫的同一细胞中,没有观察到FDA或pi分离荧光的共同定位。


最佳荧光团/ Schistosomula孵化时间
在前测中,研究了这两种染料应与寄生虫孵育多长时间,以获得最大的可重复活力数据。结果如图1和图2所示。

正如预期的那样,死寄生虫显示最高的PI发射值,而活寄生虫的信号接近媒体控制,并保持恒定的时间。含有活的和死的血吸虫混合样本的值介于两者之间。我们选择一个孵化时间20分钟收集π的数据提供了一个足够的时间窗口处理多个微量滴定板在图1(*)。而PI染色的死schistosomula导致排放增加了至少120分钟,FDA染色显示不同的结果(图2)。

活的、死的和混合的血吸虫种群产生的排放数据很快达到了一个高原(96孔板51分钟)。正如预期的那样,活虫的排放值最高,死虫的排放值最低,混合种群的排放值为中间值。我们计算出最佳的FDA孵育时间为3 - 12分钟。我们选择5分钟收集FDA数据(图2标记)。

Schistosomula的可行性响应Auranofin
为了验证实验结果,在寄生虫生长过程中,将TGR抑制剂和抗血吸虫化合物auranofin添加到寄生虫中。对血吸虫存活率有明显的可滴定的抗血吸虫作用(图3)

百分比可变性转化为探测值,也允许Auranofin LD50计算(0.82±0.49μm)。在10μm葵蛋白中看到的最大药物效果,其中微观检查Schistosomula证实死亡为100%。


结论

在本应用笔记中,我们演示了一种定量、快速和廉价的方法,可重复地测量血吸虫生存力。使用双重染色法对于消除移液误差和验证荧光差异确实是死亡率差异造成的是重要的。

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