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快速超敏感等温DNA检测使用RPA技术和BMG Labtech微孔板读卡器德赢vwin官网客服

Olaf Piepenburg Niall A. Armes Twistdx Ltd. 08/2008
  • 介绍了RPA等温核酸扩增技术
  • 样品制备程序简单,恒温操作,均质格式
  • 用于德赢vwin官网客服测定开发的BMG Labtech酶读卡器

介绍

核酸扩增技术(NAATs)是分子DNA检测的核心,包括临床诊断、环境检测、食品检测和许多其他应用。尽管基于pcr的实验室测试已经很成熟,但可以监测反应动力学的热循环设备价格昂贵,而且需要电力,通常不适合为大量最终用户提供具有成本效益的访问。

扩大用户市场需要降低设备的成本、复杂性和功率要求,并简化操作程序。最近由TwistDx开发的等温核酸扩增技术重组酶-聚合酶-扩增(RPA)正好满足这些要求。战的常数较低的反应温度,其抵抗温度波动,DNA扩增步骤的集成与专用检测探针意味着可以使用它轻松地使用标准的实验室设备如BMG LABTECH标以及小型便携设备预期在不久的将来。德赢vwin官网客服


测定原则

该技术以恒定和低温在非常短的时间框架(下降至小于10分钟)中的单个模板分子的扩增到可检测水平。


对于它在非实验室环境中的应用至关重要的是,RPA可以与非常简单的样品制备程序相结合,并可以利用稳定的反应组分。此外,通过采用一种新颖的和专有的荧光探针系统,RPA可以操作在一个同质的检测格式,方便的应用和巨大的读出速度。


RPA系统的探针使用由核酸酶目标位点分开的荧光团和猝灭剂,该靶位点仅在双相DNA上运行 - 因此在发生特异性扩增时,荧光被视为增加。


在本应用说明中,我们描述了使用BMG LABTECH微孔板阅读器进行荧光强度测量,作为使用RPA实时德赢vwin官网客服监测DNA检测反应的手段。


材料与方法

试剂
除了从Roche获得的肌酸激酶之外,如前所述纯化本实验中使用的蛋白质。PEG35000是从CALBIOCHEM获得的。Eurogentec提供寡核苷酸扩增引物和探针(含有内部FAM荧光团和相应的BHQ1猝灭剂)。


升华干燥
完整的RPA反应组分,包括探针和引物,在病毒发生冷冻干燥机的微型菌管中冻干。


样品制备
用口腔交换液在0.3 M NaOH中室温孵育5分钟制备模板材料。得到的裂解液直接用于放大反应。对照模板(女性和男性人类基因组DNA)从Promega获得。

反应设置
在每个反应中,将含有缓冲成分和模板的复水化溶液加入冻干试剂中混合,使每个反应的总体积达到50 μL。溶液的模板部分由水或300份作为对照的人类基因组DNA(女性或男性DNA;注意,这相当于150个Y染色体的拷贝)或1.5 μL的样品材料。将完成的反应转移到Greiner底部透明的384孔黑色板上,在37℃下阅读。

成绩与讨论

该验证实验的目标位于人Y-染色体(SRY)的性别测定区域内,并且相应地设计了扩增引物和检测探针。


总共有9个样本被检测在人类Y染色体上是否存在Sry目标序列。其中包括一个“无模板”对照(水),一个阳性对照(男性人类基因组DNA),一个阴性对照(女性人类基因组DNA),以及从6个个体(5名男性,1名女性)中获得的口腔交换材料。

如在材料和方法下描述的,并在37℃下监测到20分钟的总反应时间。在2秒振动周期(双轨道,1毫米)之后,每30秒采用每30秒进行读数,并使用485-12nm和520-10nm波长的激励和发射滤波器。如图2所示,阴性对照和由雌性颊换部制备的样品没有导致产生荧光信号。

相比之下,阳性对照和所有5只雄性口腔渗透均在不到12分钟内的反应中存在阳性靶标。不同样品制剂中的模板分子的确切数量可能变化,因为不量化颊样本,可能会计占扩增时间的差异,并且在六个样品反应之间的总信号强度之间。

结论

本申请说明中描述的实验显示,在由颊渗透剂制备的样品材料中检测y-染色体上的靶序列,从而验证了以单一综合格式组合工作Naat的所有重要方面的可行性:一个非常简单的样本制备程序,DNA扩增系统需要等温温度条件和均匀读出系统。


此外,建立的测定在稳定的且易于使用的制剂中递送了试剂,要求对操作的操作(两个移液/混合步骤)进行非常有限的用户输入,用于在非实验室设置中进行部署。最终,在护理点和现场测试环境中实现技术将需要使用兼容的和经济高效的手持荧光读取设备。然而,BMG Labtec德赢vwin官网客服h介质读卡器作为测定开发计划的有价值的工具,并在实验室和高通量应用中使用TwistDX技术平台。

背景

Twistdx是一家位于英国剑桥附近的Babraham研究校区的生物技术公司。公司的重点在于将其专有的核酸放大和检测技术与用户友好的样品准备程序和测试交付格式集成,为使用点市场提供便携式DNA测试测定。TwistDX还将在不久的将来提供DNA扩增和基于实验室的核酸测试的替代品,并在不久的将来。

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