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细胞凋亡和坏死的实时评估

Kevin Kupcho(1)Carl Peters(2)安德鲁尼尔斯(1) (1)Promega Corporation,Madison,Wi(2)BMG L德赢vwin官网客服abtech Inc.,NC,USA 09/2017
  • Clariostar.®使用ACU提供了一个系统,其中可以在受控环境中执行实时测量
  • 多路复用的实时 - gloTM值膜蛋白V细胞凋亡和坏死测定试剂检测与细胞凋亡相关的磷脂酰丝氨酸暴露事件,同时还报告了坏死引起的膜完整性的丧失

表的内容

总结

细胞死亡对于多细胞稳态是重要的,但它也存在于人类疾病中的不幸作用。对靶向细胞毒性和细胞保护剂的发现对于治疗癌症或神经变性至关重要。为了表征疾病模型中的失调,以及对实验刺激的反应,重要的是确定细胞死亡和反应动力学的机制。传统的实验方法通常是耗时,劳动密集,昂贵,昂贵和不足。


在这里,我们描述了Promega的新RealTime-Glo™annexin v凋亡和坏死测定,可在Live-Cell,实时格式中提供加入混合测量测定的简单性。虽然这一点www.v66088.com www.vw011.com (ACU)提供了对其保持合适的双工发光和荧光信号的敏感检测[O.2[CO2]您的细胞的环境。这组合允许在设置测试并确保您不会错过重要的蜂窝响应时,无论发生变化如何发生。

介绍

虽然细胞死亡是多细胞稳态的重要性,但在许多人类疾病中也具有不幸的作用。因此,靶向细胞毒性和细胞或细胞或细胞或细胞或细胞或细胞保护剂可能对治疗其他疾病的癌症,神经变性和一封疾病具有重要意义。为了充分欣赏疾病模型中的疑难解理和对实验刺激的反应,重要的是建立细胞死亡和义奈反应动力学的作用机制。传统的寻求细胞死亡模式的传统实验方法通常是耗时的,劳动密集型,昂贵,昂贵和不足。


在这里我们描述了凋亡和坏死的实时监测。Promega新RealTime-GloTM值Annexin V凋亡和坏死测定提供了一种在活细胞,实时格式的加入混合物测量测定的简单性。虽然Clariostar具有大气控制单元(ACU),但在保持适当的情况下提供双工发光和流发光信号的敏感检测[o2[CO2]您的细胞的环境。这组合将让您在设置测试并确保您不会错过重要的蜂窝响应时,无论发生变化如何发生。


测定原理

来自内膜lea fl et的磷脂酰丝氨酸(ps)的易位被认为是过渡到细胞凋亡的健康细胞的标志1。多种检测方法利用Annexin V与PS结合来鉴定细胞开始凋亡。


RealTime-Glo™Annexin V凋亡和坏死检测利用包含发光酶二元亚基的Annexin融合蛋白2(NanoBiT™),由于其对PS的亲和力,被引入互补接近。在时间释放底物的存在下,补充酶可以实时报告PS暴露。坏死检测试剂报告了由于坏死而引起的膜完整性的改变。总之,这些实时测量建立了细胞死亡的作用机制(凋亡、原发性坏死或替代程序)。


材料与方法

  • Realtime-Glo.TM值Annexin V凋亡和坏死检测(Promega, Cat #JA1011)
  • Clariostar.®与ACU(BMG L德赢vwin官网客服abtech)
  • 白色,清澈或不透明的底部,96孔板(Costar)
  • 来自ATCC的K562细胞®
  • 从龙沙阴性选择的自然杀伤(NK)细胞
  • 来自市售来源的其他试剂

制备RealTime-Glo™Annexin V细胞凋亡和坏死测定试剂,如技术手册所述,并在给药或治疗时添加。


对于剂量反应实验,将最大浓度为10μm的8点稀释系列的硼替佐米被施加到每孔10,000个细胞中预接种的K562细胞。还包括车辆处理和无细胞坯料。


对于NK细胞实验,用IL-15刺激NK细胞,然后以指定的比例加入到K 562细胞中。单独的NK或K562细胞用作暴露对照。使用脚本和以下设置使用Clariostar Microplate Reader完成测量和孵育。


仪器设置

RealTime-Glo™Annexin V凋亡检测
视镜设置 发光,底光学
过滤器 没有过滤器
获得 3500
常规设置 测量间隔时间 1.0秒
坏死检测
视镜设置 荧光强度,顶视音
过滤器 激励482-16
Diochroic LP504.
排放530-40
获得 在运行前调整
常规设置 沉淀时间 0.2秒
闪光数量 40
动力学和大气控制
动态设置 每个实验单独指示周期数和循环时间
孵化 37℃
ACU. 5%二氧化碳和监测氧气

结果与讨论

配备ACU的CLARIOstar能够在硼替佐米照射48小时(49个周期)中每小时实时检测一次荧光和荧光信号。在图2中,ps暴露反应(发光)先于坏死反应(荧光),表明这种治疗性蛋白酶体抑制剂的预期凋亡机制。

图3显示了单个实验可以产生的时间依赖性剂量响应曲线。结果加强了剂量和时间与反应幅度之间的关系。类似的结果也被用于检查二次ne-crotic反应导致的膜完整性的变化(数据未显示)。


本实施例探讨了刺激的自然杀伤(NK)细胞的先天能力,靶向,接合和诱导K562癌细胞群中的细胞凋亡。具体而言,在两个小时的时间路线(25个循环)上每5分钟进行混合细胞的动力学读数。数据表明,PS-informosure和细胞死亡以NK细胞数依赖性方式进行,其最大响应于在2小时内获得的NK细胞的高比率(数据未示出)。

图4显示了增加NK细胞与靶细胞的比率之间的相关性,以及指示细胞凋亡的发光信号的增加。

结论

结果显示了一种新的分析方法和仪器的结合,使用户真正地走开,并返回到杰出的结果。该结果的实时性使您能够捕获信息,而这些信息需要花费大量的努力才能通过使用以前的细胞凋亡分析技术来实现。


参考文献

1.S.J. Martin等(1995)J. Exp. Med. 182, 1545-1556。
2. A. S. Dixon等人。(2016)ACS Chem。BIOL。11,400-408。

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