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实时评估细胞凋亡和坏死

凯文·库普乔(1)卡尔·彼得斯(2)安德鲁·奈尔斯(1) (2) BMG LABTECH Inc., NC, USA德赢vwin官网客服 09/2017
  • CLARIOstar®与ACU提供了一个系统,可以在受控环境中执行实时测量
  • 多路复用的RealTime-GloTMAnnexin V凋亡和坏死分析试剂检测与凋亡相关的磷脂酰丝氨酸暴露事件,同时也报告坏死导致的膜完整性丧失

表的内容

总结

细胞死亡对多细胞稳态很重要,但它在人类疾病中也有不幸的作用。靶向细胞毒素和细胞保护药物的发现对于治疗癌症或神经退行性变是至关重要的。为了描述疾病模型中的失调和对实验刺激的反应,定义细胞死亡的机制和反应动力学是很重要的。传统的实验方法往往是耗时、劳动密集、成本高和不足的。


在这里,我们介绍了Promega新的real-time - glo™Annexin V凋亡和坏死检测方法,该方法提供了简单的添加-混合检测方法,以活细胞,实时的形式。而www.v66088.com 大气控制单元(ACU)提供了对双重发光和荧光信号的敏感检测,它保持适当的[O2]和[有限公司2你的细胞的环境。这种组合可以让你在测试完成后离开,确保你不会错过重要的细胞反应,不管什么时候发生变化。

介绍

虽然细胞死亡是多细胞稳态的一个重要的正常结果,但它在许多人类疾病中也有不幸的作用。因此,靶向细胞毒素和细胞保护剂的发现可能在治疗癌症、神经退行性变和一系列其他疾病方面具有重要意义。为了充分认识疾病模型中的失调现象,以及对实验刺激的反应,建立细胞死亡的作用机制和明确反应动力学是很重要的。处理细胞死亡模式的传统实验方法费时费力,成本高且不充分。


这里我们描述了凋亡和坏死的实时监测。Promega新RealTime-GloTMAnnexin V凋亡和坏死检测提供了简单的添加-混合检测,在活细胞,实时格式。而带大气控制单元的“克拉罗星”(ACU)提供对双重发光和荧光信号的灵敏探测,同时保持适当的[O2]和[有限公司2你的细胞的环境。这种组合可以让你在测试完成后就离开,确保你不会错过重要的细胞反应,不管什么时候发生变化。


测定原理

磷脂酰丝氨酸(PS)从内膜小叶转移到外膜小叶被认为是健康细胞向凋亡过渡的标志1。多种方法利用Annexin V与PS的结合来鉴定细胞开始凋亡。


real - time - glo™Annexin V凋亡和坏死检测利用了包含发光酶的二元亚基的Annexin -fusion蛋白2(NanoBiT™),仅由于其对PS的亲和力而进入互补接近状态。在时间释放的底物存在下,补充的酶报告实时PS暴露。坏死检测试剂报告坏死后膜完整性的变化。总之,这些实时测量方法建立了细胞死亡的作用机制(凋亡、原发性坏死或替代方案)。


材料与方法

  • RealTime-GloTMAnnexin V凋亡和坏死实验(Promega, Cat #JA1011)
  • CLARIOstar®与ACU (BMG 德赢vwin官网客服LABTECH)
  • 白色,透明或不透明底,96孔板(合星)
  • ATCC的K562细胞®
  • 龙沙阴性选择自然杀伤细胞
  • 其他可从市场上获得的试剂

real - time - glo™Annexin V凋亡和坏死分析试剂按照技术手册的指示制备,并在给药或治疗时加入。


在剂量反应实验中,最大浓度为10 μM的硼替佐米8点稀释系列应用于预接种的K562细胞,每孔10000个细胞。车辆处理和无细胞空白也包括在内。


在NK细胞实验中,用IL-15刺激NK细胞,然后按指定比例加入K562细胞。单独使用NK或K562细胞作为暴露对照。通过使用一个脚本和以下设置,使用CLARIOstar微孔板阅读器完成测量和孵育。


仪器的设置

RealTime-Glo™Annexin V凋亡检测
光学设置 发光,底部光学
过滤器 没有过滤器
获得 3500
一般设置 测量时间间隔 1.0秒
坏死检测
光学设置 荧光强度,顶部光学
过滤器 励磁482 - 16
Diochroic LP504
排放530 - 40
获得 运行前调整
一般设置 沉淀时间 0.2秒
不。的闪光 40
动力学和大气控制
动态设置 每个实验的循环次数和循环时间都单独标明
孵化 37°C
ACU 5%的二氧化碳和氧气的监测

结果与讨论

在硼替佐米48小时(49个周期)的暴露过程中,配备ACU的CLARIOstar能够每小时实时检测一次发光和荧光信号。在图2中,ps暴露反应(发光)先于坏死反应(荧光),表明预期的这种治疗性蛋白酶体抑制剂的凋亡机制。

图3说明了可以从单个实验中产生的随时间变化的剂量响应曲线。结果加强了剂量和时间在反应幅度方面的关系。类似的结果产生了检查膜完整性的改变作为二次ne-crotic反应的结果(数据未显示)。


最后一个例子探讨了受刺激的自然杀伤细胞(NK)靶向、激活和诱导K562癌细胞群凋亡的先天能力。具体来说,在2小时(25个周期)的过程中,每5分钟记录混合细胞的动力学读数。数据表明,ps暴露和细胞死亡以NK细胞数量依赖的方式进行,在2小时内对获得的高比例NK细胞产生最大反应(数据未显示)。

图4显示NK细胞占靶细胞比例的增加与表明细胞凋亡的发光信号的增加之间的相关性。

结论

结果显示了一种新的分析方法和仪器的组合,允许用户真正走开,并返回出色的结果。结果的实时性允许您捕捉信息,这将需要大量的努力来实现使用以前的细胞凋亡检测技术。


参考文献

1.马志明等(1995)《医学进展》182,1545-1556。
2.A. S. Dixon等人(2016)ACS Chem。医学杂志。400 - 408。

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