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IPSC衍生3D心脏组织的实时钙通量测量

Michael Conway Tetsuro Wakatsuki InvivoSciences 08/2014
  • 使用Fluo-4和Clariostar每001秒测量钙通量每0.01秒®
  • 作为分析复合诱导的心脏毒性的模型系统,显示了CisaPride,Thapsigargin,E4031,NiFemIPine的影响

介绍

实现新药物的批准涉及广泛的测试。虽然新药的开发人员不仅需要证明他们的候选人表现出对治疗疾病的积极效果,但他们还需要确认药物对人们的整体健康状况并不危险。在测试人类的潜在药物候选者之前,需要大量的临床前测试来预测可能是通过服用药物候选者引起的潜在不需要的副作用。虽然使用实验室动物的测试结果可以预测那些副作用,但动物模型可能对药物不同。研究人员正在寻求合适的在体外测试系统,其模仿人体组织和/或器官尽可能接近的生理状态体内回复。

传统的测试方法涉及可以在第一屏幕中有用的二维(2D)细胞培养物。然而,3D细胞培养方法可以提供更接近于中获得的数据的数据体内组织和最小化在2D培养中获得的误导结果(假阳性和假阴性)。

使用从人诱导的多能干细胞(IPSC)衍生的心肌细胞制造工程心脏组织(EHT)。我们展示人类心肌肌肉以及ehts自发地以类似的速度击败。在本申请中,我们将介绍该测试模型如何用于分析3D组织中心肌细胞钙处理的复合诱导变化,这表明药物候选者的潜在副作用。当动作电位到达细胞膜时,膜电位(-80mV)被去极化。结果电压门控L型钙(CA.2+)频道打开和加利福尼亚州2+涌入细胞,触发大型释放的CA2+从其内部储备,肌肉网(SR)。这增加了ca2+通过激活CA来启动收缩2+- 依赖性收缩蛋白。
BMG LABTECH的CLARIOstar多模微孔板读卡器可以测量细胞质Ca荧光强度的快速变化(德赢vwin官网客服每秒100个数据点或每0.01秒1个数据点)2+指示剂,Fluo-4(生命技术)。这是用来定量测量Ca2+瞬变。

材料与方法

  • Clariostar,B德赢vwin官网客服MG Labtech
  • Fluo-4(生命技术)
  • 3D组织培养微室或板,MC-8TM或MC-96TM(Invivosciences)

水凝胶溶液制备和组织形成
先前公布了一般组织制造方案。对于各种组织类型的特定协议,请联系invivosciences。


钙指示剂测量与克拉克罗斯塔尔

使用市售染料(Fluo-4-AM,Life Technologies)进行钙瞬态分析。将组织在含有氟-4- am(15μm)和37℃的Pluronic F127的Tyrodes溶液中沐浴45-60分钟。一旦通过荧光显微镜观察染料载荷,将加载溶液用脱淋溶液替换,并在37℃下孵育20分钟,然后使用ClarioStar准备样品进行样品进行研究(参见下面的仪器设置)。相同的方法可用于使用我们的协议光学地跟踪2D CA瞬态。


CLARIOstar仪表设置

测量方法: 荧光强度,井模式
单色仪: 举例:483-14和电磁:530-30
阅读模式: 底部读数
获得: 1750.
焦点: 2.0毫米
目标温度: 37℃


动力学设置

间隔数量: 1000
每间隔的闪光数量: 1
间隔时间: 0.01秒
每个孔的总测量时间: 10秒

成绩与讨论

钙指示剂的荧光强度周期性变化很明显(图1A)。在使用相邻平均或快速傅立叶转移(FFT)分析滤波平滑数据后,10个(或更多)心脏收缩重叠(图1B)及其平均值(图1C)的钙瞬态轮廓显示,钙瞬态与使用人类非衰竭心肌小梁获得的钙瞬态类似。

当用已知通过钙作为第二个使者调节心脏收缩的各种化合物,钙瞬变钙瞬变型钙瞬变曲线的变化也显而易见。

图3中的结果显示了不同浓度的CisaPride和ThapsIgrin的钙瞬态曲线,认为不会影响钙瞬变的两个组分。相反,两种已知的效果(E4031和NiFemipine)显示出对钙瞬变形状的透明浓度依赖性影响。

这些数据表明,从市场中取出的药物改变了人类EHT中的钙瞬变,这可能导致长期治疗中的心律失常或具有显着纤维化的心肌。使用人类EHTS对ECC的分析显示在药物发现的早期患者候选者中预测潜在的安全问题。


结论

利用来自各个具有不同易感性易感性和药物的各个人的心肌细胞产生EHT的能力可能成为开发更安全和更有效的个性化治疗的重要工具。


使用Clariostar酶标器读卡器,可以每秒测量100个数据点。这在这些快速的动力学反应中非常重要,允许实时测量钙瞬态测量来概况励磁收缩耦合的药物诱导的变化。

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