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实时检测活细胞中的Gs和Gi信号

Paul Tewson(1)Scott Martinka(1)Shane Tillo(1)Thom Hughes(1)Anne Marie Quinn(1)Carl Peters(2) (1) Montana Molecular (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH 07/2016
  • 来自蒙大拿分子的遗传编码生物传感器允许检测GPCR信号
  • 稳健的Z的测量,动力学读数,和剂量反应

介绍

各种测定表现出在大容量药物屏幕期间检测的效用。然而,在这些筛网的峰值下,需要在与疾病相关的活细胞中验证阳性点击,例如神经元,心肌细胞或IPSC衍生细胞系的主要培养物。在HTS中使用的许多测定在该领域不充分,因为它们通常是终点裂解测定和/或需要外源性施加底物,并且不能靶向不同的细胞群。为了满足能够检测活细胞中信号转导级联的方法的需求,蒙大拿分子已经开发出稳健的遗传编码的生物传感器。作为原理的证据,我们展示了使用ClarioStar微孔板读取器在HEK293细胞中的GS和GI信号传导的鲁棒检测。


测定原则

蒙大拿州分子的传感器包装在哺乳动物细胞(Bacmam)中优化的修饰杆状病毒。如下所示(图1)是我们的营地测定机制的示意图,其利用EPAC CAMP结合结构域的CAMP依赖构象变化,以引发FORESTEC蛋白的流动变化。传感器具有红色或绿色版本,可以在活细胞中分解。

基因编码的生物传感器可以增加或减少荧光。当cAMP产量增加时,向上增加。当cAMP产量增加时,向下的cADDis减少,使得从荧光分析中分离背景荧光很容易。对于这项研究,我们在图3中展示了向上cADDis和向下cADDis生物传感器的结果。


利用cADDis检测Gs和Gi1营地传感器
下面的示意图(图2)说明了ß2-AR偶联GS增加腺苷酸环酶(AC)活性,并且D2受体偶联GI在AC活性中降低。我们已经验证了检测Clariostar上的每个信令事件的测定®标仪。

材料与方法

  • HEK293细胞
  • 蒙大拿分子Caddis传感器
  • Greiner 96-Well F底板
  • 来自BMG Labtech的Clariostar Microplat德赢vwin官网客服e Reader

传感器转换
HEK293细胞在悬浮液中通过携带所示传感器的BACMAM转导,并在96孔板中镀。使细胞表达传感器24-28小时。用PBS交换培养基,使细胞在实验前30分钟在室温下休息。

仪器的设置

检测模式: fi(底部)
检测方法: 板模式,动力
扫描模式: 轨道平均
扫描直径(毫米): 4.
获得/焦点高度: 在测试之前调整


光学设置

励磁: F 482-16
二向西: LP 504.
排放: F 530-40

成绩与讨论

异丙肾上腺素刺激GS检测使用Caddis Camp传感器
使用HEK293细胞对异丙醇的良好表征响应用作使用ClarioStar最初评估CADDIS检测的背景。在图1中。监测3个细胞2分钟以评估基线流荧光,然后用30μm异丙肾或PBS处理,并继续进行10分钟。使用向上或向下的绿色CADDIS传感器测定性能是基于Z'系数大于0.85的鲁棒性能。由于来自传感器的信号与任何背景流荧光相反,向下传感器表现出稍微更好的性能(Z'= 0.941)。

使用Caddis传感器的无士林GI检测
我们已经将我们的cADDis传感器用于forskolin游离检测中Gi信号的检测。福斯柯林可显著增强g对腺苷环化酶的作用,并直接影响离子通道。2不需要或不建议在cADDis中使用福斯柯林,因为它会破坏生物活性。如果GPCR具有基础的Gs活性,则其反应将被福斯柯林和明显的EC放大50.GS偶联受体的激动剂将被移位,使激动剂看起来比它们更有效。在GI偶联受体的情况下,对GS刺激的影响使其更加难以抑制腺苷环酶。3.使用组成型活性GS突变体的共同表达提出了基础阵营水平。这允许实时,在活细胞中的GI信号传导的动力学测量。

结论

蒙大拿分子的遗传编码的测定与克拉氏甾型微孔板读卡器高度相容。我们获得了GI和GS信号的动力学和剂量响应数据。为Caddis传感器获得了鲁棒Z'值。


参考

1. TEWSON,P.H.等等。(2015)J. Biomol。屏幕。21(3):298-305。
2. Hoshi,T.等。(1988年)科学40(4859):1652-1655。
3. Dessauer,C.W.等人。(1998)J. Biol。化学。273(40):25831-25839。

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