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实时检测活细胞中Gs和Gi信号

保罗·陶森(1)斯科特·马丁卡(1)肖恩·蒂洛(1)汤姆·休斯(1)安妮·玛丽·奎因(1)卡尔·彼得斯(2) (1)蒙大拿分子(2)BMG实验室德赢vwin官网客服 07/2016
  • 来自蒙大拿州分子的遗传编码生物传感器允许检测GPCR信号
  • 稳健的Z的测量,动力学读数,和剂量响应

介绍

在大容量药物筛选过程中,各种检测方法都显示出了实用性。然而,在这些筛选的高潮,阳性的撞击需要在与疾病相关的活细胞中验证,如原代培养的神经元、心肌细胞或iPSC衍生细胞系。许多用于高温超导的测定方法在这方面是不充分的,因为它们通常是终点溶解测定法和/或需要外源性底物的应用,并且不能针对特定的细胞群。为了满足对检测活细胞中信号转导级联的方法的需求,蒙大拿分子公司开发了健壮的遗传编码生物传感器。作为原理证明,我们证明了使用CLARIOstar微孔板读卡器对HEK293细胞中Gs和Gi信号的可靠检测。


测定原则

蒙大拿州分子的传感器包装在哺乳动物细胞(Bacmam)中优化的修饰杆状病毒。如下所示(图1)是我们的营地测定机制的示意图,其利用EPAC CAMP结合结构域的CAMP依赖构象变化,以引发FORESTEC蛋白的流动变化。传感器具有红色或绿色版本,可以在活细胞中分解。

基因编码的生物传感器可以增加或减少荧光。当营地产量增加时,向上的毛羽增加。当cAMP产量增加时,向下的毛细减少,这使得从荧光测定中分离背景荧光很容易。在这项研究中,我们显示了从向上和向下的毛阶生物传感器的结果,如图3所示。


利用石斛检测Gs和Gi1营传感器
下面的示意图(图2)说明了ß2-AR偶联Gs增加腺苷酸环化酶(AC)活性,D2受体偶联Gi降低AC活性。我们已经验证了在CLARIOstar上检测这些信号事件的测试方法®标仪。

材料与方法

  • HEK293细胞
  • 蒙大拿分子Caddis传感器
  • Greiner 96-well F底板
  • CLARIOstar microplate读卡器来自BMG实验室德赢vwin官网客服

传感器转导
将HEK293细胞在携带传感器的BacMam悬浮细胞中转导,并置于96孔板中。细胞表达24-28小时。实验前用PBS交换培养基,让细胞在室温下静置30分钟。

仪器的设置

检测模式: FI(底部)
检测方法: 板模式,动力
扫描模式: 平均轨道
扫描直径(毫米): 4
增益/焦距: 在测试之前调整


光学设置

激励: F 482-16
二向西: LP 504
排放: F 530 - 40

成绩与讨论

异丙肾上腺素刺激用凯迪斯营地传感器检测Gs
以HEK293细胞对异丙肾上腺素的良好反应为背景,初步评估使用克拉罗星的石鳞片检测。在图3中,细胞被监测了2分钟以评估基线荧光,然后用30 μM异丙肾上腺素或PBS处理,并继续监测10分钟。使用向上或向下的green-cADDis传感器,基于大于0.85的Z’因子,测试性能是稳健的。向下传感器表现出稍好的性能(Z ' = 0.941),部分原因是来自传感器的信号与任何背景荧光相反。

使用石毡传感器检测无福斯柯林Gi
我们已经调整了我们的cADDis传感器检测Gi信号在forskolin自由分析。Forskolin能显著放大Gs在腺苷环化酶上的作用,并对离子通道有直接影响。2在cADDis试验中使用forskolin是不必要的,也不推荐使用,因为它破坏了生物活性。如果存在基础Gs活性的GPCR,则forskolin和表观EC将会夸大反应50在gs偶联受体上的激动剂的数量将被转移,使激动剂看起来比它们本身更有效。在gi偶联受体的情况下,forskolin对Gs的刺激作用使得抑制腺苷环化酶更加困难。3.通过组成活性Gs突变体的共表达提高了cAMP的基础水平。这样就可以实时、动态地测量活细胞中的Gi信号。

结论

蒙大拿州分子公司的基因编码检测与CLARIOstar微孔板阅读器高度兼容。我们获得了Gi和Gs信号的动力学和剂量响应数据。石斛传感器获得了稳健的Z '值。


参考资料

1. TEWSON,P.H.等等。(2015)J. Biomol。屏幕。21(3):298-305。
2.Hoshi, T.等(1988)《科学》40(4859):1652-1655。
3. Dessauer,C.W.等人。(1998)J. Biol。化学。273(40):25831-25839。

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