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用于监测转谷氨酰胺酶活性的实时荧光测定

Magdalena Adamszyk Andreas Heil Daniel Aeschlimann 卡迪夫大学牙科学院 04/2013
  • 异谷氨酰胺酶活性动力学分析的异肽酶测定
  • 优化的协议允许测量的快速实现和标准化
  • 测定适用于对催化调节剂/抑制剂的高通量分析

介绍

转谷氨酰胺酶(TGS)形成催化各种后期后蛋白质修饰的酶系列,例如交联,酯化和在CA中的脱胺2+- 依赖的方式。它们的主要功能是形成共价nε.-(g-谷氨酰基)赖氨酸在多肽内部或之间的键,以稳定蛋白质组合。这些酶的活性对许多器官系统的组织稳态和功能至关重要,缺乏或过量的交联活性与人类疾病过程有关。


在这里,我们以适合于高通量分析的格式使用重组TG2和荧光肽模型底物进行动力学测量。该检测原理可应用于TG6等密切相关酶的动力学研究,并可通过对主干肽序列的修饰进行优化。


测定原则

Tg酶反应是两步方法。在第一步骤中与基材形成的酶的硫酯中间体随后与亲核试剂反应以再生活性酶并释放'交联的多肽。第二步骤是可逆的,并且在过量的交联底物存在下,Tg催化异肽键水解。我们利用后一种活动进行了实时监测TG活动,并表征潜在调节剂对TG活动的影响。

ABZ-APE(G-CAD-DNP)QEA是衍生自源自已知的谷氨酰胺供体基质的淬火荧光探针,其模拟交联的TG反应产物。在该肽中,荧光团(2-氨基苯甲酰基(ABZ))通过2,4-二硝基苯基 - 野牛(CAD-DNP)取代基淬灭在第一个GLN残基上,基本上替代N中的Lys侧链ε.- (G-谷氨酸)赖氨酸连接肽(图1)。异肽键的TG2催化水解释放CAD-DNP部分(图2),因此产生λ的发光增加最大=来自ABZ组的418 nm。随后通过氨基溶解或水解进行硫酯酶中间体。反应的特异性由围绕反应性Gln残基的氨基酸残基引导。


材料与方法

  • 来自BMG Labtech的微孔板读卡器德赢vwin官网客服
  • 黑色光学底96孔板(Nunc)
  • ABZ-APE(G-CAD-DNP)QEA TG2基板(Zedira)。DMSO中50毫米库存
  • 转谷氨酰胺酶2,1 mg / ml股票,来自Zedira

测定缓冲器
测定缓冲液由62.5mm Tris / HCl,pH 7.4,125mM NaCl组成。加入甘氨酸甲基酯(或替代胺供体基质)并在使用前立即调节pH(37μC)。包括DTT以防止Tg的氧化灭活。


测试协议
用20毫米Cacl赋予微孔板读取器注射器2用于酶活化(Inj.1)和H.2O或20 mm mgcl2用于控制反应(Inj.2)。预热的测定缓冲器和37˚C和37˚C平衡仪器室。在测定缓冲液中稀释底物ABZ-APE(G-CAD-DNP)QEA(1:800),并将80μl混合物加入96孔板的孔中。添加所需量的酶,例如,1毫克TG2,并用H组成体积2o至90μl。立即转移到读者和开始程序中。


反应混合物(最终浓度)
最终测定体积为100µl,包括1- 100µg/ml TG2, 50µM Abz-APE(g-cad- dnp)QEA, 10-55 mM甘氨酸甲基酯或替代亲核试剂,以及1-5 mM DTT。注射后有2毫米钙化钙2存在于样品。


仪器设置

模式: 荧光强度,板模式
过滤器:

激励:ex320

排放:440 - 10

光学: 最佳
闪光数量: 20.
循环: 90.
周期: 40 s(12孔)
注射周期: 10.
注射体积: 10μl.
摇晃: 每个周期后5秒
温度: 37℃

成绩与讨论

在加利福之后2+可以观察到荧光的增加取决于样品中酶的浓度(图3)。

TG2介导的底物转化为直链,用于> 30分钟,并且初始反应速率可以从前15-25个数据点的线性回归导出(图3)。


结论

这里报道的是使用BMG Labtech微孔板读卡器测定用荧光模型衬底ABZ-APE(GCAD-DNP)QEA的TG2异肽酶活性的优化实验条件,以产生快速,直接和敏感的测定。德赢vwin官网客服自动注射CA2+由于酶的活化结合了在相当长的时间内持续测量荧光强度的能力,有限的光漂白有助于动力学数据的获取。小样本量和板型使该方法具有成本效益,适用于高通量分析。


致谢

从腹股沟共享英国和关节炎研究德赢Vwin安全吗英国(18461年)和博士学位的博士学位,从卡迪夫大学/总统的奖学金计划到马和啊,这项工作得到支持。

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