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哺乳动物细胞内氧的实时测量

弗兰克·毛雷尔(1)康恩·凯里(2) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech(2)安捷伦技术 02/2016
  • 新O.2- 敏感细胞穿透纳米粒子探针尿滤灰内 - 细胞内氧测定
  • 细胞溶质O.2张力显着的信号转导和细胞新陈代谢
  • 专用测量协议,[o2使用一个鼠标单击“规模转换和数据分析”

表的内容

介绍与测定原理

如最近的出版物所示,细胞中可用氧的水平显著影响细胞生理学、信号转导和细胞对药物治疗的反应。1.2.3尽管知道这些,大多数体外研究环境氧气下的细胞培养和研究——忽略了大气和培养基之间以及培养基和细胞内细胞环境之间的氧气梯度。为了方便细胞内氧的定量,安捷伦技术公司开发了MitoXpress细胞内氧分析试剂盒,该试剂盒基于专有的O2- 敏感的细胞穿透纳米颗粒探针。4.


在本应用笔记中,我们展示了MitoXpress Intra分析是如何在配备有大气控制单元(ACU)的CLARIOstar酶标仪上进行的。ACU是一个微处理器控制的单元,可以调节CO2和o.2在读者内以再现最佳的生理以及基于活细胞的测定所需的缺氧条件。在过夜装载期间,细胞筛选尿映射内纳米粒子探针,并实时响应2D培养物中的细胞内氧浓度以及各种3D系统,包括Matrigel,RAFT TM,微发布,Alvetex®,mimetix.®和其他脚手架。氧气淬灭探针的磷光发射,使得磷光与[O.2]。

细胞呼吸可以降低细胞内氧浓度的水平,产生局部氧气梯度。在这里所示的规格(图1)中,用于在环境氧培养的细胞,细胞内[o2使用MITOxPRESS腔内测量的,对于代谢无活性细胞的〜14%,对于代谢活性细胞类型的〜7%。但是,当环境o2使用ACU,浓度降低至〜6%,细胞内[o2对于代谢较少的活性细胞落到〜4.5%,并且与代谢活性细胞的缺氧贴近缺氧。


由于细胞在培养中经历的真正氧浓度是环境o的函数2浓度,细胞代谢和播种密度,椎骨油瘤内提供理想的工具,以智能地调节这些参数以实现所需和特异性的细胞内氧浓度。同样,斑块压缩intra是一个理想的工具,用于监测蜂窝内部的实时变化[o2[响应治疗扰动线粒体功能和细胞代谢的治疗。

材料与方法

  • MitoXpress内部(mx - 300 - 4www.agilent.com.
  • Clariostar.®微孔板读者配备了ACU

仪器设置

检测模式: 双读,TR-F,底读
方法: 板模式动力学
循环数量: 300
周期时间: 60秒
不。每口井的闪光: 100.
井多晶体: 是的
注射体积: 各种使用onboardInjectors.
目标温度: 37℃
目标O.2专注: 各种各样的
目标公司2专注: 出发

视镜设置

励磁 二向色性 排放 Int。开始 Int。时间 获得
1 F:ex tr F:LP TR F:645-20. 30μs. 30μs. 1900
2 F:ex tr F:LP TR F:645-20. 70μs. 30μs. 1900

数据计算
需要通过MARS软件进行数据转换,将信号转换为生存期,并从生存期转换为%O2。ClarioStar和FluoStar Omega读者配备预安装的测量协议和[o2]比例计算模板,允许用户单鼠标点击数据转换。

结果与讨论

对环境氧气减少的细胞反应
图2显示了细胞呼吸对氧的影响2肝细胞在3D胶原培养(RAFT TM)内生长的浓度。ACU用于在19%之间产生逐步系列的大气环境,靠近0%的氧气。

由微孔板读卡器ACU设定的初始氧浓度为约19%,但在3D培养中测量的细胞的氧浓度约为10%。这减少了[o2是由于这种代谢活跃的细胞类型通过细胞呼吸消耗了局部氧气的快速消耗。在每个环境氧浓度设置下,实际的[O2这些肝细胞经验丰富在2至10%之间。在研究缺氧的研究人员通常使用的环境氧气水平上,可以看出当地的[o2]细胞接近零。


复合添加的影响
样本数据如图3所示。参照图3和图3.图4分别示出了从影响线粒体功能和细胞代谢,2D和3D培养的药物的加入药物的直接和长期效果。

序贯复合添加是Clariostar的船上注射器的一个特征,这提供了研究不同化合物对细胞的反对作用的可能性[O.2同一口井。


细胞呼吸减少o2单层培养的细胞浓度为~ 10%,3D培养的细胞浓度为~9%。通过线粒体解耦FCCP治疗增加耗氧率,可引起急性和显著的[O2]〜2-3%,而线粒体抑制剂抗霉素的呼吸完全抑制o返回o2到环境浓度。添加DMSO用作对照,并且在氧浓度上没有引起的。

结论

生理o.2和培养细胞的衬底环境,其中细胞显着影响信号转导和对药物治疗的细胞反应。对于第一次安捷伦的裂纹瘤内部 - 细胞内氧气测定套件为研究人员提供了易于使用的工具,它们可以测量实际的实际[o2[他们的细胞培养系统实现对对细胞生理的影响的了解。


配备ACU的Clariostar是测量细胞内的绝佳选择[O.2]。该仪器配有温度和大气控制以及所有要求的振动选项。这些特征对于进行长期细胞培养是必要的,同时测量细胞代谢中的改变引起的。通过降低的环境氧含量。在板载注射器可用于添加化合物。

参考文献

1. Chapple SJ。等等。(2015)免费Radic Biol Med。[epub]。
2. Zhdanov AV。等等。(2015)Exp Cell Res。(330)13-28。
3.波特M.等。(2016)Adv Exp Med Bio。(876)257-263。
4.海恩斯和凯恩(2015)线粒体药物1,(1264)探测线粒体功能,分子生物学方法。

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