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哺乳动物细胞内氧的实时测量

弗兰卡·毛雷尔(1)康恩·凯里(2) (2)安德赢vwin官网客服捷伦科技(Agilent Technologies) 02/2016
  • 新啊2- 敏感细胞穿透纳米粒子探针尿滤灰内 - 细胞内氧测定
  • 细胞溶质O.2张力显著影响信号转导和细胞代谢
  • 专用测量协议,[o2点击鼠标即可进行比例转换和数据分析

表的内容

介绍及分析原理

正如最近的出版物所阐明的,细胞内的可用氧水平显著影响细胞生理、信号转导和细胞对药物治疗的反应。1.2.3尽管有这些知识,大多数体外研究在环境氧下培养和研究细胞-忽略氧在大气和介质之间以及介质和细胞内细胞环境之间的梯度。为了促进细胞氧化的定量,安捷伦技术开发了MitoXpress细胞内氧测定试剂盒,基于专有的O2- 敏感的细胞穿透纳米颗粒探针。4.


在本应用笔记中,我们展示了如何在配备大气控制单元(ACU)的CLARIOstar微孔板阅读器上进行MitoXpress内部分析。ACU是一种微处理器控制单元,可以调节CO2和o.2在读者中重现最佳的生理以及缺氧条件所需的活细胞为基础的分析。MitoXpress纳米颗粒探针在一夜加载期间被细胞吸收,并在2D培养以及广泛的3D系统(包括Matrigel, RAFT™,microtissue, Alvetex)中实时响应细胞内氧浓度的任何变化®, Mimetix®和其他脚手架。氧气淬灭探针的磷光发射,使得磷光与[O.2]。

细胞呼吸可以降低细胞内氧浓度的水平,产生局部氧气梯度。在这里所示的规格(图1)中,用于在环境氧培养的细胞,细胞内[o2使用MITOxPRESS腔内测量的,对于代谢无活性细胞的〜14%,对于代谢活性细胞类型的〜7%。但是,当环境o2使用ACU,浓度降低至〜6%,细胞内[o2对于代谢较少的活性细胞落到〜4.5%,并且与代谢活性细胞的缺氧贴近缺氧。


由于细胞在培养中经历的真正氧浓度是环境o的函数2浓度,细胞代谢和播种密度,MitoXpress Intra提供了理想的工具来智能调节这些参数,以实现所需的和特定的细胞内氧浓度。同样,MitoXpress Intra是监测细胞内实时变化的理想工具[O2[响应治疗扰动线粒体功能和细胞代谢的治疗。

材料与方法

  • MitoXpress内部(mx - 300 - 4www.agilent.com.
  • CLARIOstar®装有ACU的微孔板阅读器

仪器的设置

检测模式: 双读,TR-F,底读
方法: 板模式动能
循环数量: 300
周期时间: 60秒
不。每口井闪光次数: 100.
井多晶体:
注入体积: 各种使用onboardinjectors
目标温度: 37°C
目标O.2浓度: various
目标公司2浓度: 出发

光学设置

二向色性 排放 Int.开始 Int.时间 获得
1 F:ex tr F:LP TR F:645-20. 30μs. 30μs. 1900
2 F:ex tr F:LP TR F:645-20. 70μs. 30μs. 1900

数据计算
需要MARS软件进行数据转换,将信号转换为生命周期,并从生命周期转换为%O2。CLARIOstar和FLUOstar Omega阅读器都预先安装了测量协议和[O2scale计算模板,允许用户单鼠标点击数据转换。

结果与讨论

对环境氧气减少的细胞反应
图2显示了细胞呼吸对O的影响2肝细胞在3D胶原培养(RAFT TM)内生长的浓度。ACU用于在19%之间产生逐步系列的大气环境,靠近0%的氧气。

酶标仪ACU设定的初始氧浓度为~ 19%,而3D培养时测得的细胞氧浓度约为10%。这减少了[O2是由于这种代谢活跃的细胞类型通过细胞呼吸消耗局部氧气的快速消耗。在每个环境氧浓度设置下,实际的[O2而这些肝细胞的经历率要低2 - 10%。在研究缺氧的研究人员通常使用的环境氧水平(~5%)中,可以看到局部的[O2]细胞接近零。


复合添加的影响
样本数据如图3所示。参照图3和图3.图4分别示出了从影响线粒体功能和细胞代谢,2D和3D培养的药物的加入药物的直接和长期效果。

序贯复合添加是Clariostar的船上注射器的一个特征,这提供了研究不同化合物对细胞的反对作用的可能性[O.2在同一口井里。


细胞呼吸减少o2浓度从环境到基线~ 10%的细胞作为单层生长和~9%的细胞在3D培养。线粒体解偶联剂FCCP处理增加的耗氧速率导致[O2到~2- 3%,而线粒体抑制剂抗霉素完全抑制呼吸则返回O2环境浓度。DMSO的加入作为对照,对氧浓度没有显著影响。

结论

生理o.2和培养细胞的衬底环境,其中细胞显着影响信号转导和对药物治疗的细胞反应。对于第一次安捷伦的裂纹瘤内部 - 细胞内氧气测定套件为研究人员提供了易于使用的工具,它们可以测量实际的实际[o2[他们的细胞培养系统实现对对细胞生理的影响的了解。


配备ACU的Clariostar是测量细胞内的绝佳选择[O.2]。该仪器配备了温度和大气控制以及振动选项,以满足所有要求。这些特征对于进行长期的细胞培养是必要的,同时测量细胞代谢的改变,如环境氧含量的降低。板载喷油器可用于添加化合物。

参考文献

1. Chapple SJ。等等。(2015)免费Radic Biol Med。[epub]。
2. Zhdanov AV。等等。(2015)Exp Cell Res。(330)13-28。
3.波特M.等。(2016)Adv Exp Med Bio。(876)257-263。
4.Hynes and Carey (2015) Mitochondrial Medicine 1, (1264) probe Mitochondrial Function, Methods in Molecular Biology。

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