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哺乳动物细胞单层中基因编码的氧化还原探针的实时监测

Daria eyerina Bruce Morgan Tobias P Dick 德国癌症研究中心(DKFZ) 05/2014
  • 利用roGFP2-Orp1作为H2O2探测
  • BMG 德赢vwin官网客服Labtech微孔板读卡器足够敏感,以允许来自哺乳动物细胞单层的比率rogfp流动测量

介绍

氧化还原过程在细胞生理学和病理学中起重要作用。用于监测细胞氧化还原的一种特别强大的工具是基于氧化还原敏感生命荧光蛋白(RogFP)的遗传编码的生物传感器。Rogfps含有两种模具残留物,所述半胱氨酸残基适于存在于蛋白质β-筒的表面上,其能够形成二硫键。可以通过适当的氧化还原酶的遗传融合来响应特定氧化铈物种的rogfp。例如,Rogfp2至硫醇过氧化物酶ORP1的融合产生H.2O2- 敏感探针。


测定原则

当在510nm监测流动发射时,Rogfp2在405nm和488nm处呈现两个流出激发最大值。在减少或氧化rogfp2二硫化物时(图1)在相对方向上偏移的两个激发最大值的相对强度(图1)。因此,通过同时监测两个激发最大值的流动发射,可以确定探针氧化程度。

荧光微孔板阅读器是基于rogfp的高通量筛选的理想系统,例如识别调节氧化还原稳态的化合物。然而,基于微孔板阅读器的细胞单层roGFP测量需要高灵敏度的仪器。在本应用笔记中,我们证明了BMG LABTECH微孔板阅读器能够在96孔成像板中生长德赢vwin官网客服的哺乳动物细胞单层中进行基于罗格fp2的测量。

材料与方法

  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH多模微孔板阅读器
  • 黑色fl底96孔板(BD Falcon)
  • 过氧化氢(H2O2)(Sigma,H1009)
  • 成像缓冲液(130mM NaCl,5mm KCl,10mm D-葡萄糖,1mm MgCl2,1 mm cacl2,20毫米hepes)

实验程序
第1天
细胞稳定表达细胞溶质H.2O2将探针roGFP2-Orp1接种于96孔成像板(20000个细胞/孔)。同样数量的非转导细胞被播种作为背景对照。选择细胞号是为了在测量当天获得100%的合流。


第2天
除去生长培养基,并用PBS洗涤细胞两次,施用120μL成像缓冲液。探针对H注入H的响应2O2随着时间的推移

仪器设置

测量类型: 荧光强度,底部读数
测量模式: 板模式动力学
不。周期: 47.
周期: 90秒
闪光数量: 10.
光学设置: 双彩色
第1号: 400 520.
2号: 485 520
扫描模式: 轨道平均
扫描直径: 3毫米
注射: 使用船上注射器
注射周期: 5
体积: indiv。
泵速: 300毫升/秒

成绩与讨论

利用控制软件的当前状态特征,可以实时遵循反应进展。典型的信号曲线如图2所示。

在表达Rogfp2-Orp1构建的样本中,可以清楚地看到它后2O2注入400/520测量的值将增加,而485/520的值分别降低。在没有构造或没有注射控制中没有任何效果。


对测量数据进行处理,得到探头氧化度值。在图3中,我们监测了罗格fp2 - orp1探针在融合肺腺癌细胞单层中的反应,加入一剂H2O2。微孔板读取器的灵敏度使得这种测量很容易实现(图3)。

我们接下来评估了化学化合物对细胞氧化还原稳态的影响。对于表达细胞溶质H的肺腺癌细胞2O2探针ROGFP2-ORP1用不同浓度的感兴趣的浓度处理过夜。随后用单个推注攻击相同的细胞2O2


如图4所示,研究发现该化合物显著削弱了H细胞的恢复2O2以集中依赖的方式挑战。该结果表明该化合物破坏了细胞内的还原系统,因此可以被认为是敏化癌细胞对化学或放射疗法敏化癌细胞的候选药物。

结论

BMG Labtech的酶读者能够监测哺乳动物细胞单层德赢vwin官网客服罗格夫2的氧化还原探针的比率 - 度量流响应。

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