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用裂纹瘤内使用细胞内氧的实时监测

詹姆斯海恩斯(1)Conn Carey(1)Catherine Wark(2) (1)安捷伦技术(2)BMG Labtech德赢vwin官网客服 03/2012
  • 方便,实时监测细胞单层内的细胞内氧
  • 膜可渗透,超敏感,探针随着氧气水平耗尽的增加而增加
  • 轻松评估代谢活性的瞬态变化,以及缺氧,细胞外探测不能做

介绍

分子氧是所有有氧生物的关键底物和电子传输链(ETC)的终端受体。这种高度信息性的细胞新陈代谢和线粒体功能的标记受ATP / ADP比率,可用氧气的水平和信号传导分子(如NO和CA)的作用密切调节2+。分子氧的分析有助于阐明临界生化途径;包括细胞存活和死亡,线粒体功能,化合物的毒理学影响和由各种刺激或疾病状态引起的代谢改变。迄今为止,细胞内分子氧的常规分析受到缺乏在细胞单层内的氧气的合适方法。

测定原则

MITOXPRESS intra是使用基于板的时间分辨FLOORMOR法为分子氧的细胞内分析开发的氧敏感探针。测量基于O的能力2淬灭被内吞作用造成的探针的发射。随着细胞呼吸,细胞单层内的氧气浓度被耗尽,并且该耗竭被视为探针信号的增加,表示为探针寿命,在分辨时分磷光强度的比例测量之后。这允许关于在多个样品中产生细胞单层内的分子氧浓度的实时信息,而不需要专用成像设备。监测这种流离变率的能力特别提供了尤为乐的信息,因为它允许评估代谢活性的瞬时变化,并提供对缺氧研究中的关键参数的访问,这超出了细胞外传感方法的能力。


材料与方法

  • 来自安捷伦技术(MX-300-4)的尿映射内部血液氧气测定
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器配备大气控制单元(ACU)

探针制备和细胞载荷
将细胞生长至在补充有胎儿牛血清,L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的合适培养基中的完全培养基,其在细胞培养物处理的96孔板上。替换含有100μl正常生长培养基(10%FBS)的播种培养基,含有尿滤糊体探针,10μg/ ml探针,并过夜返回培养物。在测量之前,用150μL预热培养基取代培养基。


测量
使用BMG Labtech微孔板读取器和脚本功能测量样品中的细胞内氧。德赢vwin官网客服对于欧米茄读卡器的发射和EM 645-20,最佳滤波器波长为340 TR L,用于em 655-50,并为克拉克罗斯塔尔的EM 645-20。磷光强度在30μs的延迟时间和70μs(具有30μs窗口时间)的延迟时间测量,随后随后转换为磷光寿命的这些强度的比率,如图1所示。这些转换是在MARS Data Anaylsis软件的帮助下执行的。

成绩与讨论

典型的数据输出
当分析完全控制的单层,ETC活性在测量中,通常在饱和水平以下的氧浓度开始。降低等活性导致导致探针信号的降低导致的细胞内氧浓度的增加,同时增加等活性导致细胞内氧浓度的降低导致探针信号的增加(图2)。根据所涉及的过程和测量条件,增加可能延长或更短暂的瞬态。

探测反应
测量筛分内探针的磷光蒸发时间有利于测量细胞单层内细胞内氧的基础水平。探针的响应在配备有大气控制单元(BMG Labtech)的微孔板读卡器上测量的抗霉素处理的HepG2细胞中。德赢vwin官网客服该仪器允许环境o2浓度逐步减少。非呼吸单层对此新o平衡的时间2可以观察到浓度(图3),具有新的稳态探针信号重复这种新浓度。这种校准还允许测量的寿命值自动转换为O.2浓度,从而允许在这种规模中观察探针响应。

测定性能和细胞应答
图4A显示用电子传输链抑制剂(抗霉素)和解偶联器(FCCP)处理的HepG2细胞的效果。监测单层(DE)氧合的幅度,一致性。在抑制导致探测器的情况下,促成导致细胞内氧的直接降低,可以高度一致,导致提高氧气消耗,导致探针寿命的增加,同时抑制导致探针寿命增加。增加FCCP浓度增加了脱氧的速度,同时增加了细胞数增加了脱氧(未示出的数据)的深度。用Ryr1激动剂卤代的HCT116细胞处理过碘碘的磷酸钙也通过钙介导的代谢率升高(图4B),使用细胞外分析来显而易见的反应。

结论

尿滤灰内允许在传统的微量滴定板格式上方便地监测细胞内氧。探头是“自载”,并提供出色的空白性能信号。这允许研究目前超出现有探针技术能力的各种参数。

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