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使用MitoXpress-Intra实时监测细胞内氧

James Hynes (1) Conn Carey (1) Catherine Wark (2) (1)安捷伦技术(2)BMG Labtech德赢vwin官网客服 03/2012
  • 方便,实时监测细胞单层内的细胞内氧
  • 细胞膜透性,超敏感,探头增加当氧气水平在细胞内耗尽
  • 很容易评估代谢活动的短暂变化,以及细胞外探针无法做到的缺氧

表的内容

介绍

分子氧是所有需氧生物的关键底物,也是电子传递链的末端受体。这种细胞代谢和线粒体功能的高信息标记物受ATP/ADP比率、可用氧水平和信号分子(如NO和Ca)的作用密切调节2 +。分子氧的分析有助于阐明临界生化途径;包括细胞存活和死亡,线粒体功能,化合物的毒理学影响和由各种刺激或疾病状态引起的代谢改变。迄今为止,细胞内分子氧的常规分析受到缺乏在细胞单层内的氧气的合适方法。

测定原理

MitoXpress Intra是一种用于细胞内分子氧分析的氧敏感探针,使用基于平板的时间分辨荧光测定法。测量是基于O的能力2淬灭被内吞作用吸收的探针的发射。当细胞呼吸时,细胞单层内的氧气浓度被消耗,这种消耗被看作是探针信号的增加,在时间分辨磷光强度的比率测量后表示为探针寿命。这样就可以在多个样本中生成细胞单层内分子氧浓度的实时信息,而不需要专门的成像设备。监测这种波动的能力提供了特别丰富的信息,因为它可以评估代谢活动的短暂变化,并在缺氧研究中提供了超出细胞外传感方法能力的关键参数。


材料与方法

  • MitoXpress细胞内氧含量测定
  • 德赢vwin官网客服BMG LABTECH微孔板读卡器配有大气控制单元(ACU)

探针制备和细胞加载
将细胞生长至在补充有胎儿牛血清,L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的合适培养基中的完全培养基,其在细胞培养物处理的96孔板上。替换含有100μl正常生长培养基(10%FBS)的播种培养基,含有尿滤糊体探针,10μg/ ml探针,并过夜返回培养物。在测量之前,用150μL预热培养基取代培养基。


测量
使用BMG LABTECH微孔板阅读器和脚本功能测量样品中的细胞内氧。德赢vwin官网客服最佳滤光波长是340 TR L的激发,EM 655-50的发射,EM 645-20的克拉罗星。磷光强度在延迟时间30µs和70µs(30µs窗口时间)下测量,这些强度的比率随后转换为磷光寿命,如图1所示。这些转换是在火星数据分析软件的帮助下进行的。

结果与讨论

典型的数据输出
当分析一个完全融合的单层,等活动导致测量通常开始氧气浓度低于空气饱和水平。等活动下降导致胞内氧气浓度的增加导致减少在探测信号等活动增加导致细胞内氧浓度下降导致增加探头信号(图2)。增加可能会持续相当长一段时间或多个瞬态,根据过程和测量条件。

探测反应
米托霉素内探针的磷光寿命的测量有助于测量细胞单层内细胞内氧的基础水平。在装有大气控制单元(BMG LABTECH)的酶标仪上检测抗霉素处理过的HepG2细胞,验证了探针的响应。德赢vwin官网客服该仪器允许环境O2浓度逐步降低。无呼吸的单层细胞平衡到新的氧所需的时间2可以观察到浓度(图3),新的稳态探测信号反映了这个新的浓度。这种校准还允许测量的寿命值自动转换为O2浓度,从而允许探头响应在这个尺度上观察。

检测性能和细胞反应
图4A显示了电子传递链抑制剂(Antimycin)和解偶联剂(FCCP)处理HepG2细胞的效果。监测单层氧合的大小、浓度。解偶联引起的氧消耗增加与这些特征高度一致,即细胞内氧的立即减少导致探针寿命的增加,而抑制作用则引起相反的结果。增加FCCP浓度增加脱氧速度,而增加细胞数量增加脱氧深度(数据未显示)。用RyR1激动剂ryan碘处理HCT116细胞也会通过钙介导的代谢率增加导致单分子层的短暂脱氧(图4B),使用细胞外分析不容易明显的反应。

结论

MitoXpress Intra允许方便的监测细胞内氧在传统的微量滴定板格式。探针是“自加载”,并提供良好的信号空白性能。这允许对各种参数进行调查,目前超出了现有探测技术的能力。

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