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朊病毒播种的实时震动诱导转化试验

玛吉中村 德赢vwin官网客服 12/2012
  • 朊病毒播种监测的速度较快,吞吐量测定较高
  • 先进的酶标仪震动和温度控制功能是检测效果的关键
  • 每15分钟测量一次荧光底部读数,持续20-68小时

表的内容

介绍

朊病毒是可传输的病原体,其导致人类和动物中脑蛋白的异常折叠。感染导致脑损伤并且是致命的。一些例子神经退行性疾病是Scrapie,牛海绵状脑病和Creutzfeldt-Jakob疾病。


在此之前,朊病毒的研究是通过长时间的生物测定来进行的,即对感染的动物进行长时间的研究(1-6个月)。饲养受感染的动物既费时又费钱。蒙大拿州哈密尔顿洛基山实验室的研究人员开发了一种新的朊病毒播撒试验,称为实时震动诱导转化试验(RT-QuIC),它提供了测量感染样本中朊病毒水平的终点定量。与以前的方法相比,这种方法既更快又有更高的吞吐量。该检测可在短短20小时内完成,如果不是比整个动物模型更灵敏的话,也是同样灵敏的。


德赢vwin官网客服BMG LABTECH的Omega系列阅读器有能力在很长一段时间内震动和孵化微孔板。一个POLARstar®Omega每15分钟测量RT-QuIC样品20-68小时,交替摇晃1分钟和休息1分钟。一个软件脚本被开发来控制摇晃和休息的时间需要激活的试验。

测定原理

结合部分原始的震动诱导转化(QuIC)试验和淀粉样蛋白播种(ASA)试验,RT-QuIC试验用于估计朊病毒的相对播种量。该试验测量连续稀释的样品,统计估计播种剂量(SD)。在试验中,将非常少量的感染性朊病毒添加到正常朊病毒蛋白中,或引起朊病毒蛋白的错误折叠,如该病中所见。定量方法是通过测定样品的系列稀释度和测定播种活性损失(SD50),这是终点稀释。

材料与方法

  • Nalgene Nunc黑色,平底清晰
  • 96好板
  • Nalgene Nunc板封膜
  • POLARstar或FLUOstar®ω,BMG L德赢vwin官网客服ABTECH

实验

仪器设置在42°C孵育整个20-68小时。创建了一个脚本来使用两个测试运行协议。其中一个方案是摇盘子一分钟,然后休息一分钟。第二种方案是每15分钟使用底部光学进行荧光端点测量。荧光染料硫黄素T (ThT)被用作朊病毒的播种标记。当ThT被添加到重组朊病毒蛋白中,当聚合发生时,随着时间的推移,荧光增强,ThT就被合并了。

仪器设置

荧光端点-底部读数
激发滤光片: 450nm.
排放过滤器: 480海里
闪光: 20.
获得: 2000
摇晃: 700rpm双轨道

分析

Spearman-Kärber分析,类似于生物测定的致死剂量为50% (LD50),用来估计每克组织中有50%的孔变成ThT阳性的播种剂量或稀释度(SD50/G)。对于Spearman-Kärber分析一种稀释系列,其具有至少一个稀释度,得到100%THT阳性,并且至少选择0%THT阳性的稀释度。


结果与讨论

软件脚本被用来测量20-68小时的RT-QuIC分析。数据收集为8个重复井的平均相对荧光单位。每个图中只显示每45分钟的数据。


除了线性和轨道外,Flyostar和Polarstar Omega还能够以独特的双轨道模式摇动。为了温育,将温度在整个测量期间保持在42℃。欧米茄的高质量设计和制造允许研究人员在摇晃或温度波动中休息的时间连续测量。收集数据而不会中断,并将其输出到BMG LabTech的数据分析软件(MARS)和Excel。德赢vwin官网客服

图1和2显示了RT-Quic测定,因为它涉及仓鼠瘙痒病脑匀浆(BHS)。图1使用了接种后80-85天收获的仓鼠BHS(DPI),而图2使用了接种后10天收获的仓鼠BHS。

50%播种剂量(SD50)定义为在一半的复制孔中充分增强的荧光量。在这种情况下,近似的SD50以10E-9稀释的痒病BH原液(深蓝色线)等量(种子体积)2 μl获得。因此,Spearman-Kärber估计的SD50/2μL为10E9.1,为SD50/ g是10 e12汽油。这个SD的日志50(~11)与LD的测井值吻合较好50(~10)在生物测定中发现。

在这种情况下,近似的SD50以2 μl等分(种子体积)的10E−5稀释的痒病10dpi 263K BH标本(绿线)获得。这给了SD50/2μl105.5和sd5010 e8.2 / g。


不出所料,瑞典民主党5085 DPI (10E12)比10 DPI (10E8.2)起病时间长,每克组织的起病率高。这些RT-QuIC结果与生物测定结果有很好的相关性。这一数据表明,RT-QuIC可以被认为是一种更快、更高通量的替代全动物生物测定法。这也表明,早在接种后10天,就可以用这种试验方法检查动物。


结论

可以使用RT-Quic测定和微孔板读取器更快地测量朊病毒种子和较高的产量。使用RT-Quic显示的一些可传染性的海绵状脑病包括仓鼠和绵羊瘙痒病,鹿慢性浪费疾病,Creutzfeldt-Jakob疾病(CJD)和牛海绵状脑病(BSE)。该测定既比过去的生物计量越来越敏感。来自BMG Labtech的Omega系列板式读卡器既具有功能且稳健,以承受该德赢vwin官网客服试验所需的高速摇动的数天。

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