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实时震动诱导朊病毒播种转化试验

Maggie Nakamura. 德赢vwin官网客服 12/2012
  • 朊病毒播种监测的速度较快,吞吐量测定较高
  • 用于振荡和温度控制的先进的酶式读卡器是测定效果的关键
  • 荧光底部读数测量每15分钟拍摄20-68小时

介绍

朊病毒是可传输的病原体,其导致人类和动物中脑蛋白的异常折叠。感染导致脑损伤并且是致命的。一些例子神经退行性疾病是Scrapie,牛海绵状脑病和Creutzfeldt-Jakob疾病。


以前,朊病毒的研究是通过长时间的生物测定来进行的,感染的动物被研究了很长一段时间(1-6个月)。维持被感染的动物既费时又费钱。位于蒙大拿哈密尔顿的落基山实验室的研究人员开发了一种新的朊病毒种子测定方法,称为实时震动诱导转化试验(RT-QuIC),它为测量受感染样本中的朊病毒水平提供了终点定量。与以前的方法相比,这种方法既快又高通量。该试验可在短短20小时内完成,而且与整个动物模型一样敏感,甚至更敏感。


德赢vwin官网客服BMG Labtech的Omega系列读者能够长时间摇动和孵育微孔板。一个偏光棒®欧米茄用于每15分钟测量RT-Quic样品20-68小时,同时交替摇动一分钟并休息一分钟。开发了一种软件脚本以控制激活测定所需的摇动时间和休息。

测定原则

RT-QuIC试验结合了原震动诱导转化(QuIC)试验和淀粉样蛋白播种试验(ASA)的部分内容,用于估计朊病毒播种的相对量。测定样品的连续稀释度,统计估计播种剂量(SD)。在该试验中,将非常少量的感染性朊病毒添加到正常的朊病毒蛋白中,以种子化或导致朊病毒蛋白的错误折叠,就像在疾病中看到的那样。该方法通过测量样品的连续稀释度和测定播种活性损失(SD50)来定量,这是终点稀释。

材料与方法

  • Nalgene Nunc黑色与清楚的平底底部
  • 96孔板
  • Nalgene Nunc版封膜
  • 北极星或Fluostar.®欧米茄,BMG德赢vwin官网客服 Labtech

实验

仪器设置为42°C孵育整个20-68小时。创建了一个脚本来使用两个测试运行协议。一种方案是摇晃盘子一分钟,休息一分钟。第二种方案设置为每15分钟使用底部光学测量一次荧光端点。荧光染料硫黄素T (ThT)被用作朊病毒的种子标记物。当ThT被添加到重组朊病毒蛋白中,当聚合发生时,它会被合并,随着时间的推移导致荧光增加。

仪器设置

荧光端点-底部读数
励磁过滤器: 450nm.
排放过滤器: 480海里
闪烁: 20.
获得: 2000年
摇晃: 700rpm双轨道

分析

Spearman-Kärber分析,类似于生物测定的致命剂量为50%(LD50),用于估计播种剂量或稀释,其中50%的孔变为每克组织(SD)50/G)。对于Spearman-Kärber分析一种稀释系列,其具有至少一个稀释度,得到100%THT阳性,并且至少选择0%THT阳性的稀释度。


成绩与讨论

使用软件脚本测量20-68小时的RT-QuIC测定。数据以相对荧光单位的平均值收集8个重复井。每个图中只显示每45分钟的数据。


除了线性和轨道外,Flyostar和Polarstar Omega还能够以独特的双轨道模式摇动。为了温育,将温度在整个测量期间保持在42℃。欧米茄的高质量设计和制造允许研究人员在摇晃或温度波动中休息的时间连续测量。收集数据而不会中断,并将其输出到BMG LabTech的数据分析软件(MARS)和Excel。德赢vwin官网客服

图1和2显示了RT-Quic测定,因为它涉及仓鼠瘙痒病脑匀浆(BHS)。图1使用了接种后80-85天收获的仓鼠BHS(DPI),而图2使用了接种后10天收获的仓鼠BHS。

50%的播种剂量(SD50)定义为在一半的复制孔中充分增强的荧光量。在这种情况下,近似SD5010E-9稀释剂(深蓝线)等分2 μl(种子体积)即可获得。因此,SD的估计为Spearman-Kärber50/2μL为10E9.1,用于SD50/ g是10e12。这个SD的日志50(~11)与LD的log值吻合较好50(〜10)在生物测定中发现。

在这种情况下,近似SD50用10E-5稀释的2μL等分试样(种子体积)达到瘙痒病10DPI 263K BH股(绿线)。这给了一个sd50/2μl105.5和sd50/ g 10e8.2。


正如预期的那样,SD50/克的85 dpi样品(10e12)的组织高于10dpi(10e8.2),因为它具有较长的发作时间。这些RT-QUIC结果与生物测定结果完全相关。该数据表明,RT-Quic测定可以被认为是全动物生物测定的更快,较高的产量替代品。这也表明,可以使用该测定检查接种后10天的动物。


结论

可以使用RT-Quic测定和微孔板读取器更快地测量朊病毒种子和较高的产量。使用RT-Quic显示的一些可传染性的海绵状脑病包括仓鼠和绵羊瘙痒病,鹿慢性浪费疾病,Creutzfeldt-Jakob疾病(CJD)和牛海绵状脑病(BSE)。该测定既比过去的生物计量越来越敏感。来自BMG Labtech的Omega系列板式读卡器既具有功能且稳健,以承受该德赢vwin官网客服试验所需的高速摇动的数天。

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