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筛选组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)活性化合物

法兰卡·莫尔(1)Sheraz Gul(2)GESA将(2) (1) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH (2) European ScreeningPort GmbH 12/2013
  • 用化学发光法在384孔板上筛选活性化合物
  • 概念验证屏幕和计数器屏幕数据在Pherastar上快速且可靠地获得®FS.在欧洲筛选端口使用筛选设施

介绍

组蛋白是小碱性蛋白质。堆叠的配置中的DNA在组蛋白周围束缚以在复制过程之前构建染色质。在翻译之后,组蛋白侧链通常是修改的。这包括乙酰化和脱乙酰化以及甲基化,ADP-核糖化和磷酸化。组蛋白脱乙酰化由构建复合物与组蛋白的酶进行。这些复合物靶向特定启动子以通过在特定核肉中通过脱乙酰化抑制转录。HDAC抑制剂(HDACI)已被用于治疗神经系统症状,以及癌症,寄生和佛经疾病。为了发现具有HDAC活性的潜在抑制剂的化合物(I和II类),在Pherastar上进行化学发光证明筛选FS.microplate reader来自BMG 德赢vwin官网客服LABTECH。


测定原则

Promega的HDAC- glo™I/II检测检测HDAC I类和II类的活性(图1)。乙酰化的肽作为HDAC底物。去乙酰化后,加入一种蛋白酶,它裂解去乙酰化的底物并释放氨基荧光素,荧光素酶立即消耗氨基荧光素。产生的发光信号与HDAC的活性成正比。

材料与方法

  • Promega的HDAC-Glo I/II
  • 白色384孔板,体积小,不装订
  • 来自Labcyte的回声液体处理系统
  • PHERAstarFS.microplate reader来自BMG 德赢vwin官网客服LABTECH

标准抑制剂的剂量响应曲线
溶解DMSO中的抑制剂,并在Labcyte板中制备DMSO中的稀释系列。使用Labcyte Echo将抑制剂转移到测定板上。在测定缓冲液中稀释于所需浓度(2x×浓度)的酶。稀释显影剂溶液1:1000在底物溶液中。将5μl酶加入板和密封件。离心板1分钟。向每个孔中加入5μl显影剂试剂。密封测定板。将盘子离心1分钟。在板式振动器上摇盘30秒。 Incubate plate at room temperature for 10 min. Detect the luminescence signal on the PHERAstarFS.


概念验证屏和反屏
使用Labcyte Echo液体处理系统添加来自文库的50ng化合物。加入5μl酶,密封和离心机。然后加入5μL试剂,密封,离心机,并如上所述摇动板。孵育10分钟后,在Pherastar中读取板材FS.。为了识别假阳性,使用含有去乙酰化底物的对照底物进行计数器筛选。对照底物在实验缓冲液中稀释1:10 000。使用Labcyte Echo将待测化合物转移到试验板上,并在每孔中加入5 μl对照底物。离心1分钟,摇匀30秒。不应添加任何酶。加入5 μl试剂,密封,离心,摇板。孵育10分钟后,应在pherstar中读取平板FS.

PHERAstarFS.仪器的设置

测量类型: 发光
测量模式: 端点
光学模块: 亮度+模块
获得: 3600
测量时间: 1.0秒(概念屏幕和计数器屏幕的0.2秒)

成绩与讨论

为了找到筛选用的酶浓度,进行了酶滴定。加入显像剂后立即开始酶滴定测定,每2分钟收集数据点,持续46分钟。20分钟后达到平台期(数据未显示)。基于这些发现,所有进一步的微孔板用5 nM的酶制备,并在室温下培养10分钟,然后开始测量。

标准抑制剂的剂量-响应曲线
为了测试标准抑制剂的测定方法,制备并测定了不同浓度的抑制剂。结果如图2所示。

在MARS软件中应用了4个参数。由此产生的ic50价值为55纳米,并同意我们对该标准抑制剂的经验。


概念验证屏和反屏
从LOPAC文库中筛选抗HDAC活性化合物。通过在MARS软件中设置限制,将平板中的筛选结果可视化。结果如图3所示。

抗HDAC活性化合物会抑制HDAC活性。使用MARS数据分析软件对数据进行评估,并根据%抑制率计算,使用以下公式:

大多数有希望的井被定义为90%或更高的抑制率(图3中红色标记的井)。


在复合屏幕中发现了一些点击。其中一些在计数器屏幕上也显示出来,表明假阴性,对显影液中的蛋白酶或荧光素酶都有活性。这表明计数筛是非常有用的,特别是当测定包括一个偶联酶系统来检测目标活性。


结论

此应用笔记显示pherstarFS.可用于筛选测定以及测定发育。数据是快速可靠地获得的。即使在使用当前状态选项期间也可以识别命中。可以使用MARS数据分析软件轻松调整数据处理和颜色梯度微孔板视图。

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