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使用HTS荧光极化法筛选泛素稳压剂和抗癌靶CSN5的筛选剂

U. Hassiepen M.D. Jones R. Assenberg I. Bechtold C. Renats M. Renatus B. Martoglio 瑞士诺华制药公司 04/2017
  • 以HTS兼容的格式确定去类泛素化蛋白酶的活性
  • 使用荧光团具有较长的荧光寿命,以延长分析窗口
  • PHERAstar®由于速度和精度,使测量成为可能

概要

Cullin-RING E3泛素连接酶(CRLs)可被类泛素化修饰激活,并由COP9信号素体(CSN)完成的去类泛素化修饰失活。据报道,在非活性状态捕获crl可提高肿瘤抑制因子。因此,抑制CSN是一种潜在的癌症治疗方式。

在这里,我们表明用于用于发现CSN抑制剂的CRL底物的高通量去Neddylation测定的开发。该荧光极化使用具有相对长的荧光寿命的荧光团优化测定。

在384孔板上进行实验,并在一个PHERAstar®微孔板读者提供了130mp的检测窗口。阅读器同时检测两个偏振通道的能力加速了测量,并使动能读取成为可能。因此,该方法既适用于CSN抑制剂的发现,也适用于表征。

介绍

COP9信号组(CSN)催化Cullin环E3泛素连接酶(CRL)的去NeDdylation将连接酶转化为无活性状态。文献证据表明,在非活性状态下捕获CRL将在升高的水平下保持所选择的肿瘤抑制剂。因此,CSN的蛋白水解亚基CSN5的抑制代表了用于治疗癌症的潜在新型模态(图1)。


探测生物化学蛋白酶测定以探测CSN的去丁二丁含量活性,以通过高通量筛选(HTS)化学出发点进行药物发现。

测定原则

建立一个适当的酶活性测定的主要并发症是CSN5仅在CSN复合物的背景下具有蛋白水解活性。此外,csn催化的去类泛素化修饰需要类泛素化的cullin复合物作为底物(即CRNB-DDB1-DDB2-Rbx-Nedd8)。因此,具有酶活性的蛋白酶和相应的底物都是多结构域蛋白复合物。因此,该试验必须适应于检测释放的8 kDa泛素样蛋白Nedd8从大约。270kda的CRL复合物(图2a)。


作为测定读数,我们施加了FOREOR倒源极化(FP),其依赖于溶液中分子的旋转运动。大分子旋转慢于小分子。因此,FLOROOCHROOCORE紧密地结合到比对较大分子结合的发射光的小分子结合。为了优化相对于预期质量变化的蛋白酶活性测定的测定窗,我们选择了FP uorophore pureTime-22(Pt22)作为Fp探针。Pt22是一种吖啶酮染料,表现出22 ns的显着长流动寿命(FLT)。由于FP值均取决于蛋白质和探针的FLT的分子量,因此使用长FLT探针PT22的使用提供了明显的优势,这些优势在使用常用探针如亚历克斯氟®488,在仅3-4 ns的范围内的FLT。当在调查高分子质量的蛋白质或蛋白质复合物时,PT22探针显着的长FLT显着增加了FP测定的窗口(图2B)。

材料与方法

  • CliniPlates (ThermoScientific) 384 well black
  • Cul4a E3连接酶Modi Fi Ed用Fl uorophore标记的NEDD81(Fl uorophore Pt22,GE Healthcare,TTP Labtech)
  • CSN Complex1
  • PHERAstar®FS,B德赢vwin官网客服MG Labtech.

实验的程序
将CSN酶溶液(12.5μL,浓度为150mP)加入到0.25μl的试验化合物中以在室温下预孵育1小时。通过添加CUL-NEDD8-PT22亚串(12.5μL,浓度150nm)开始反应1


对于比较Tr-FRET测定,与Alexa 488偶联的衬底组合使用标记的抗His抗体的铽。请联系BMG Labtech以德赢vwin官网客服获取更多信息。

仪器设置

荧光偏振 TR-FRET
光学设置

FP 540 590 590光学模块

刺激:540

排放:(平行和
垂直)590

lanthascreen光学模块

激励:337

结核病:488

Alexa488排放:520

测量前调整的焦点和收益,目标MP 75

集成开始:70μs

集成时间:500μs

前视
一般设置 10个闪光灯(闪光灯)
0.1 s稳定时间
测量模式 动力学参数:
印版模式,60s cycle time, 240 cycle number or endpoint
端点测量
摇晃 第一次循环前摇动5秒,双轨道500转 第一次循环前5秒,双轨道500转

成绩与讨论

利用荧光寿命为22ns的PT22荧光团监测CSN5的蛋白水解活性,从而使Cul4A泛素连接酶释放出PT22- nedd8。蛋白水解活性降低了FP值。随着CSN5浓度的增加,FP值下降更快。130mp的总体检测窗口对于筛选和随后的抑制剂验证和表征活性都足够了²。

当用于HET FID和在铅和铅优化阶段期间,与先前建立的TR-FRET活性测定(图4)相比,FP测定良好地进行了良好的。TR-FRET测定使用通过链霉抗生物素蛋白 - 生物素系统引入的TB螯合物,并与NEDD8相应的供体对配合结合的Alexa488 Fl uoroOphore。我们目睹了许多高效的CSN5小分子抑制剂在药物发现项目的后期进行干扰,而不是FP测定读数。

结论

这里提出的荧光偏振分析可以筛选CSN5的抑制剂,CSN5是一种调节泛素连接酶活性并与癌症有关的金属蛋白酶。通过选择荧光寿命较长的荧光探针来优化检测窗口,因为荧光探针的值取决于蛋白质的分子质量和探针的荧光寿命。高灵敏度的PHERAstar阅读器与同时检测两个发射通道使快速FP测量。因此,这允许以一种连续的方式运行检测,即在平板读数之前不淬灭蛋白酶活性,因此在HT筛选和抑制剂表征方面有一个精简和经济的工作流程。


参考资料

1.A. Schlierf et al. (2016) Nat. common . 2016;7: 13166。
2.[j] .中国人民大学学报(自然科学版),2009,(2)

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