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使用HTS荧光极化法筛选泛素稳压剂和抗癌靶CSN5的筛选剂

U. Hassiepen M.D. Jones R. Assenberg I. Bechtold C. Renats M. Renatus B. Martoglio 诺华Pharma AG,瑞士 04/2017
  • 以HTS兼容格式确定去丁基化蛋白酶的活性
  • 使用具有长凌镜寿命的FL Uorophore以延长测定窗口
  • Pherastar.®通过速度和准确性实现测量

概括

Cullin-Ring E3泛素连接酶(CRL)通过NedDylation激活并通过COP9信号组(CSN)完成的去丁基化灭活。据报道,捕获其无活性状态的CRL以提高肿瘤抑制器。因此,CSN的抑制是癌症治疗的潜在模态。

在这里,我们表明用于用于发现CSN抑制剂的CRL底物的高通量去Neddylation测定的开发。这荧光极化使用具有相对长的荧光寿命的荧光团优化测定。

在384孔板中执行测定并在a上读取它Pherastar.®微孔板读者提供了130mp的测定窗口。读者的同时检测两个偏振通道的能力加速了测量和启用的动力学读取。因此,测定适用于CSN抑制剂的发现和表征。

介绍

COP9信号组(CSN)催化Cullin环E3泛素连接酶(CRL)的去NeDdylation将连接酶转化为无活性状态。文献证据表明,在非活性状态下捕获CRL将在升高的水平下保持所选择的肿瘤抑制剂。因此,CSN的蛋白水解亚基CSN5的抑制代表了用于治疗癌症的潜在新型模态(图1)。


探测生物化学蛋白酶测定以探测CSN的去丁二丁含量活性,以通过高通量筛选(HTS)化学出发点进行药物发现。

测定原则

建立适当的酶活性测定的主要并发症是CSN5在CSN复合物的背景下仅蛋白水解活性活性。此外,CSN催化的去丁基化需要氨丁基化的CULLIN复合物作为底物(即,CRNB-DDB1-DDB2-RBX-NEDD8)。因此,酶活性蛋白酶和相应的基质都是多域蛋白质复合物。结果,必须调整测定法检测8kDa泛素样蛋白NEDD8的释放。270 KDA CRL复合物(图2A)。


作为测定读数,我们施加了FOREOR倒源极化(FP),其依赖于溶液中分子的旋转运动。大分子旋转慢于小分子。因此,FLOROOCHROOCORE紧密地结合到比对较大分子结合的发射光的小分子结合。为了优化相对于预期质量变化的蛋白酶活性测定的测定窗,我们选择了FP uorophore pureTime-22(Pt22)作为Fp探针。Pt22是一种吖啶酮染料,表现出22 ns的显着长流动寿命(FLT)。由于FP值均取决于蛋白质和探针的FLT的分子量,因此使用长FLT探针PT22的使用提供了明显的优势,这些优势在使用常用探针如亚历克斯氟®488,在仅3-4 ns的范围内的FLT。当在调查高分子质量的蛋白质或蛋白质复合物时,PT22探针显着的长FLT显着增加了FP测定的窗口(图2B)。

材料与方法

  • 临床(Thermoscienti fi c)384孔黑色
  • Cul4a E3连接酶Modi Fi Ed用Fl uorophore标记的NEDD81(Fl uorophore Pt22,GE Healthcare,TTP Labtech)
  • CSN Complex1
  • Pherastar.®FS.,B德赢vwin官网客服MG Labtech.

实验程序
将CSN酶溶液(12.5μL,浓度为150mP)加入到0.25μl的试验化合物中以在室温下预孵育1小时。通过添加CUL-NEDD8-PT22亚串(12.5μL,浓度150nm)开始反应1


对于比较Tr-FRET测定,与Alexa 488偶联的衬底组合使用标记的抗His抗体的铽。请联系BMG Labtech以德赢vwin官网客服获取更多信息。

仪器设置

荧光极化 TR-FRET.
视镜设置

FP 540 590 590光学模块

刺激:540

排放:(平行和
垂直于590

lanthascreen光学模块

激励:337

结核病:488

ALEXA488排放:520

测量前调整的焦点和收益,目标MP 75

集成开始:70μs

集成时间:500μs

顶级光学
常规设置 10闪光灯(闪光灯)
0.1秒的安定时间
测量模式 动力学参数:
板模式,60秒循环时间,240周期数或终点
端点测量
摇晃 在第一次循环之前振动5秒,双轨道500rpm 在第一次循环之前,双轨道500rpm

成绩与讨论

使用具有相对长的荧光寿命的PT22 Fl uorophore 22ns的寿命来监测CSN5的蛋白水解活性,从而从Cul4a泛素连接酶中释放Pt22-NEDD8。蛋白水解活性导致FP值的降低。随着CSN5的增加,FP值更快地降低。筛选和随后的抑制剂验证和表征活动²进行130mP的整体测定窗口。

当用于HET FID和在铅和铅优化阶段期间,与先前建立的TR-FRET活性测定(图4)相比,FP测定良好地进行了良好的。TR-FRET测定使用通过链霉抗生物素蛋白 - 生物素系统引入的TB螯合物,并与NEDD8相应的供体对配合结合的Alexa488 Fl uoroOphore。我们目睹了许多高效的CSN5小分子抑制剂在药物发现项目的后期进行干扰,而不是FP测定读数。

结论

这里介绍的FOOREOR晶体偏振测定允许筛选CSN5的抑制剂,该抑制剂,其调节泛素连接酶活性并涉及癌症的活性。通过选择具有显着的长流荧光寿命的FP探针来优化测定窗口,因为FP值取决于蛋白质的分子量和探针的流动寿命。Pherastar读卡器的高灵敏度以及同时检测用于快速FP测量的发射通道。因此,这允许以连续的方式运行测定,即,在板读数之前,不猝灭蛋白酶活性,因此在HT筛选和抑制剂表征中贫化和经济工作流动。


参考

1. A. Schlierf等人。(2016)NAT。安排。2016;7:13166。
2. J. Woelcke和U Hassiepen(2009)CRC Press 2009,Taosheng Chen

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