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布雷特测定的顺序或同时发射检测

Marjan Orban. 德赢vwin官网客服 12/2014
  • 用于高吞吐量和快速动力学的板载(内部)试剂注射器
  • 阳性和阴性对照之间的50倍

介绍

生物发光谐振能量转移(BRET)是监测分子间相互作用的选择系统体内。BRET是一种先进的、非破坏性的、基于细胞的分析技术,非常适合蛋白质组学的应用,包括受体研究和信号转导通路的映射。该实验基于含有肾素酶(Rluc)的融合蛋白和黄色荧光蛋白(YFP)之间的非辐射性能量转移。BRET信号是由coelenterazine衍生物底物的氧化产生的。


对于此应用,请注意,BRET2™演示套件已被用于证明在BMG Labtech微孔板读卡器上执行BRET测定的可行性。德赢vwin官网客服BRET DEMO KIT将细胞可渗透和无毒的Coelentazine衍生物谱系DeepBluec TM(DBC)和绿色荧光蛋白(GFP2)的突变体作为受体。这些化合物在早期变体上显示出改善的光谱分辨率和敏感性。

材料与方法

通过来自制造商的正态分布通道获得所有材料。

  • BRET2™演示套件,PE生命科学
  • 白色384-Well Optiplate™,PE生命科学

实验
DEMO试剂盒包括BRET2™蛋白质相互作用测定的开发的描述。以下部分重点介绍了分析协议中推荐的微孔板读卡器设置。


BRET2TM值演示套件试剂:

  • 非转染CHO细胞提取物
  • 负控制(RLUC + GFP2不融合在一起)
  • 阳性对照(Rluc-GFP2融合)
  • Deepbluec™
  • BRET2™测定缓冲器

测定方案(适用于白色384孔板)

1.添加BRET2™测定缓冲器:

  • A10-D12:15μLBRET2™缓冲液

2.添加10μL每种细胞提取物(图1):

  • A10-A12:未转染的细胞(空白)
  • B10-B12:底片。BRET2™控制(Rluc + GFP2)
  • C10-C12:POS。BRET2™控制(RLUC-GFP2)
  • D10-D12:BRET2™测定缓冲器

3.DBC的自动注入和测量:

将准备好的平板放入仪器中,注入DBC溶液。

  • A10-D12:在10μm下注射25μl的DBC

机载试剂注入器允许高通量分析和快速动力学信号的测量。测量数据采用MARS数据分析软件进行评估。

仪器设置

Fluostar omega. Polartar omega. Clariostar. Pherastar.
检测模式 发光,井模式
同时双排放
顺序双排放
过滤器设置 410-80
515-30.
410-80
515-30.
410-80
515-30.
BRET2光学模块
获得 3800. 3800. 3800. 3800.
测量间隔时间(秒) 1.0 0.02 1.0 0.02
数量。间隔 50. 50. 50. 50.
注射开始时间(秒) 0 0 0 0
泵速度(μl/ s) 260. 260. 260. 260.

成绩与讨论

当供体和受体紧密接近时,由DBC的催化降解导致的能量从RLUC转移到GFP2,然后将在其特征波长下发射流荧光。


负控制的动力学曲线(原始数据 - 空白)如图2所示,适用于两个通道。515nm通道的低值表明不会发生谐振能量传递。虽然阳性对照显示由于BRET效应,在410nm处显示410nm处的值和515nm通道的升高值。

计算得到的BRET比值表明了蛋白质-蛋白质相互作用的发生体内。这种类型的检测消除了在光输出中的流出引起的数据可变性,其可以通过例如变型找到。在测定体积,细胞类型,每孔的细胞数和/或在板上的信号衰减。

在图3中,空白校正的BRET2™比值(阴性和阳性对照)显示并被确定为:

MARS数据分析软件可以轻松使用工具,以便在仅1鼠别1鼠标中进行比率计算。使用同时双发射的测量的负面和阳性对照的信号分别显示出约0.06和3.3的值,这导致了大约50的因子和这些控制之间的明显辨别。使用顺序双发射的测量的负面和阳性控制的信号分别导致约0.05和1.9的值,这导致尺寸约为40(图4)。

这些对照之间的高因素是由阳性控制(Rluc-GFP2)的艺术融合构建引起的,从而产生极高的布雷。真实的测定样品可能会导致较低的比率。然而,BRET测定显示不适用于供体蛋白的光漂白或光异构化,或来自细胞或微孔板的自动荧光。此外,BRET2中供体和排放峰之间的大光谱分辨率TM值(115 nm)大大提高了信号与背景比,传统的BRET和FRET技术通常只有50 nm的光谱分辨率。


结论

几个测量量化的BRET2TM值使用顺序或同时双发射成功测量测定。但是,同时双重发射选项将导致更高的测定窗口。在此旁边,可以监视每个时间的更多数据点(每秒50测量),并且测量本身在同时测量两个波长的速度更快。用于384孔板格式的内部试剂注射器为这种测定提供了很大的优势。

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