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布雷特测定的顺序或同时发射检测

Marjan班 德赢vwin官网客服 12/2014
  • 机载(内部)试剂注射器高通量和快速动力学
  • 阳性和阴性对照之间的50倍

介绍

生物发光共振能量转移(BRET)是一种监测分子间相互作用的系统在活的有机体内。BRET是一种先进,无损,基于细胞的分析技术,非常适合蛋白质组学应用,包括受体研究和信号转导途径的映射。该测定基于含有雷尼拉荧光素酶(Rluc)的融合蛋白之间的非辐射能量转移,例如,黄色荧光蛋白(YFP)。BRET信号由Coelenterazine衍生物底物的氧化产生。


对于此应用,请注意,BRET2™演示套件已被用于证明在BMG Labtech微孔板读卡器上执行BRET测定的可行性。德赢vwin官网客服BRET DEMO KIT将细胞可渗透和无毒的Coelentazine衍生物谱系DeepBluec TM(DBC)和绿色荧光蛋白(GFP2)的突变体作为受体。这些化合物在早期变体上显示出改善的光谱分辨率和敏感性。

材料与方法

通过来自制造商的正态分布通道获得所有材料。

  • BRET2™演示工具包,PE生命科学
  • 白色384-Well Optiplate™,PE生命科学

实验
演示试剂盒中包含了对BRET2™蛋白-蛋白相互作用测定方法开发的说明。下面重点介绍测定方案中推荐的酶标仪设置。


BRET2.TM演示套件试剂:

  • 未转染的CHO细胞提取物
  • 负控制(RLUC + GFP2不融合在一起)
  • 阳性对照(Rluc-GFP2融合在一起)
  • DeepBlueC™
  • BRET2™测定缓冲器

测定方案(适用于白色384孔板)

1.加入BRET2™检测缓冲液:

  • A10-D12: 15µL BRET2™缓冲液

2.添加10μL每种细胞提取物(图1):

  • A10-A12:未转染的细胞(空白)
  • b10-b12:neg。BRET2™控制(RLUC + GFP2)
  • C10-C12: Pos. BRET2™control (Rluc-GFP2)
  • D10-D12:BRET2™测定缓冲器

3.自动注入DBC和测量:

将准备好的板插入仪器中,并用DBC溶液将注射器LL。

  • A10-D12:在10μm下注射25μl的DBC

板载试剂喷射器允许测量高通量测定和快速动力学信号。使用MARS数据分析软件评估来自测量的数据。

仪器设置

Fluostar omega. Polartar omega. Clariostar. PHERAstar
检测模式 发光,模式
同时双发射
顺序双排放
过滤器设置 410 - 80
515 - 30
410 - 80
515 - 30
410 - 80
515 - 30
BRET2光学模块
获得 3800. 3800. 3800. 3800.
测量间隔时间(秒) 1.0 0.02 1.0 0.02
不。的。时间间隔 50 50 50 50
注射开始时间(秒) 0. 0. 0. 0.
泵的速度(µl / s) 260 260 260 260

成绩与讨论

当供体和受体紧密接近时,由DBC的催化降解导致的能量从RLUC转移到GFP2,然后将在其特征波长下发射流荧光。


负控制的动力学曲线(原始数据 - 空白)如图2所示,适用于两个通道。515nm通道的低值表明不会发生谐振能量传递。虽然阳性对照显示由于BRET效应,在410nm处显示410nm处的值和515nm通道的升高值。

计算的布雷特比表明蛋白质 - 蛋白质相互作用的发生在活的有机体内。这种类型的检测消除了由光输出波动引起的数据变异性,光输出波动可以通过变化发现,例如,试验体积,细胞类型,每孔细胞数和/或平板信号衰减。

在图1中。在图3中,示出了为阴性和阳性对照的空白校正的BRET2™比率,并确定为:

MARS数据分析软件提供了简单易用的工具,只需点击鼠标即可完成比率计算。使用同时双发射的测量,阴性和阳性控制的信号分别显示值约为0.06和3.3,这导致因子约为50,并在这些控制之间有明显的区别。使用顺序双排放测量的阴性和阳性控制信号分别导致值约为0.05和1.9,从而导致因子约为40(图4)。

这些对照之间的高因子是由于阳性对照的人工融合构造(Rluc-GFP2)导致极高的BRET。实际的分析样品可能会导致较低的比率。然而,BRET检测显示供体蛋白没有光漂白或光异构化,也没有细胞或微孔板的自荧光。此外,BRET2的施主峰和发射峰之间有较大的光谱分辨率TM(115nm)大大改善了传统上使用的布雷特和FRET技术的背景比率,其通常具有50nm光谱分辨率。


结论

几个测量量化的BRET2TM已经成功地使用连续或同时双发射进行了测定。然而,同时双排放选项将导致更高的检测窗口。除此之外,每次可以监控更多的数据点(每秒50次测量),而且测量本身要快得多,因为可以同时测量两个波长。384孔板格式的内置试剂注射器为这种分析方法提供了很大的优势。

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