301

同时检测活细胞中GPCR第二信使

P. Tewson(1)S. Martinka(1)S. Tillo(1)T. Hughes(1)。Quinn(1)C. Peters(2) (1) Montana Molecular, Bozeman, MT (2) 德赢vwin官网客服BMG LABTECH, Cary, NC 12/2016
  • BMG Labtech's Clariostar活细胞GQ信号传导的量化德赢vwin官网客服®微孔板读者
  • 多路复用以使用动力学读数监控信号转导级联

介绍

用遗传编码构建的活细胞测定,Fl荧光生物传感器可以在细胞裂解物中测量的终点测定来提供显着的优点,因为可以在与疾病相关的细胞中监测关于细胞反应的时序和位置的功能信息。荧光生物传感器是基础研究的工具,现在已经过了针对自动化板读卡器的检测进行了优化。1我们之前证明了蒙大拿州分子对CLARIOstar上cAMP的活细胞cADDIS试验可以产生高Z值,这是一种稳健筛选试验的特征。2在这里,我们展示了如何在活细胞中通过DAG和PIP检测与Gq信号通路相关的第二信使2和加利福尼亚州2+。通过在单个测定中组合光谱不同的传感器,我们表明可以同时检测两个响应。通过使用ClarioStar微孔板读取器使用滤光器或LVF单色仪来实现这些响应的敏感性检测。

测定原则

蒙大拿州分子的生物传感器由于包装在修饰杆状病毒(Bacmam)中,哺乳动物细胞中的最佳表达。图1显示了DAG传感器的机制的示意图,其中插入圆形允许的荧光蛋白在蛋白激酶C的DAG结合结构域附近插入。类似的传感器用于检测CA2+和点2

每个传感器都有一个红色或绿色版本,可以通过光谱解析。通过将红色和绿色传感器组合在单个转换步骤中,可以同时检测两个第二信使的变化。DAG生物传感器可作为在流动荧光(向下DAG)中的减少或在流动下增加(向上DAG)。两个版本都表示活细胞中二酰基甘油的增加。


Gq检测使用DAG, PIP2和加利福尼亚州2+传感器
Montana分子开发了一种用于明确检测GQ信号传导的生物传感器套件。3、4图2说明了HM1R介导的GQ信号响应于卡酰基。我们验证了PIP的传感器2,二酰基甘油(DAG)和CA2+在ClarioStar microplate读卡器上。

材料与方法

  • HEK293细胞
  • 蒙大拿分子DAG传感器,PIP2传感器,r-geco ca2+在Bacmam包装的传感器
  • Greiner 96-Well F底板
  • 来自BMG Labtech的Clariostar Microplat德赢vwin官网客服e Reader

在悬浮液中对HEK293细胞进行Bacmam携带的所指示的传感器的转导。随后在96孔微孔板中镀细胞,并且允许传感器表达进行24-36小时。在实验培养基之前30分钟被交换为PBS,并使细胞在室温下静置。

仪器的设置

检测模式: fi(井模式),底光学
闪光次数: 5.
扫描模式: 轨道
扫描直径(毫米): 2
获得/焦点高度: 在测试运行之前调整
间隔时间: 3-11秒

光学设置 绿色
励磁: F 482-16 560-15
二向西: LP 504. AUTO580.5.
排放: F 530-40. 618-49.



注射设置

体积(μl): 50.
泵速(μl/ s): 85.
注射开始时间: 30.

成绩与讨论

FI Gure 3中的结果表明DAG传感器表现出优异的测定性能。

图4显示了在多路复用实验中对卡酰基的响应的结果。结果表明,在复合注射液之后,钙释放的快速释放以及快速生产DAG。

图5显示了另一个多路复用实验。在这种情况下,使用向下的DAG传感器和PIP传感器2

结论

ClarioStar提供高敏感性检测遗传编码的蒙大拿分子传感器。谱分辨变体表示GQ激活后多个第二信使的同时变化。


参考资料

1. TEWSON,P.,等人(2016)J. Biomol。屏幕。21:298-305
2.Tewson, P.,等(2016)实时检测活细胞中的Gs和Gi信号
3.丁,Y.等人(2015)自然方法12:195-198
4. TEWSON,P.,等人(2012)同时检测活细胞中CA2 +和二酰基甘油信号

去顶级