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荧光素酶报告分析的同时双发射检测

Megan Dobbs(1)Douglas Hughes(1)Janaki Narahari(1)JAE Choi(1)Georgyi Los(1)Brian Webb(1)Eric Matthews(2)Carl Peters(2) (1)Thermo Fisher Scientific(2)BMG德赢vwin官网客服 Labtech 03/2013
  • 使用来自BMG Labtech的微孔板读卡器进行双荧光素酶测定德赢vwin官网客服
  • 光谱分辨率允许检测一个样品中的两个荧光素酶活性
  • 同时双排放检测允许一个读取评估

介绍

基于荧光素酶的报告分析使用在荧光素酶基因上游插入遗传调节元件。结果是由于宽动态范围和敏感检测,用于监测细胞中基因表达的优秀工具。测量由转染的荧光素酶报告基因的表达产生的发光以量化生物途径的顺式作用或反式作用组分的活性。在双荧光素酶的测定中,一种荧光素酶的表达值通常与所研究的受试者有关,而另一个荧光素酶报告称为转染效率和细胞活力的指示。


测定原则

Thermo Scientific™Pierce™Luciferase Dual光谱测定基于使用的双荧光素酶酶的使用,提供了一种简单的单步检测方案,所述荧光素酶的配对是光谱分辨的。因此,它们的活性可以在同一样品中具有高灵敏度(图1)测量,而不具有分化荧光素酶信号所需的通常猝灭步骤。三种双重测定系统,其中红萤火虫荧光素酶与绿色配对Renilla.高斯或者塞普里纳荧光素酶可用。

检测来自两种光谱分辨的荧光素酶的活性是BMG Labtech多维酶微孔板读卡器的任务理想地适用。德赢vwin官网客服可以使用使用两个光电倍增管(PMT)的同时双发射选项来测量来自两个记者的光,或者可以顺序测量,另一个发射。在这里,我们证明了Pierce™Luciferase Dual-Scresce报告分子的敏感性,在归一化到对照记者的标准化之后,通常是红色萤火虫荧光素酶的鉴定后至少100,000倍的荧光素酶浓度范围。


材料与方法

  • HEK293表达稳定的细胞系塞普里纳高斯, 绿色的Renilla.CMV启动子控制下的红色萤火虫荧光素酶
  • Pierce™Luciferase细胞裂解缓冲液
  • Pierce™塞普里纳-Firefly Luciferase双光谱测定套件
  • Pierce™高斯-Firefly Luciferase双光谱测定套件
  • Pierce™Renilla.-Firefly Luciferase双光谱测定套件
  • 白色,96孔F底板(Thermo Scientific)
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读卡器

HEK293细胞系稳定表达塞普里纳高斯, 绿色Renilla.用Pierce™Luciferase细胞裂解缓冲液裂解红萤火虫荧光素酶。1:10在裂解缓冲液中制备稀释液。进行每种连续稀释的重复分析(10μl/孔)。含有不同第二报告(10μL/孔)的细胞裂解物作为对照。用于含细胞裂解物的连续稀释液塞普里纳高斯,或绿色Renilla.荧光素酶,第二个控制记者是红色的萤火虫。对于含有红色萤火虫的细胞裂解物的连续稀释,第二个控制记者是塞普里纳荧光素酶。为每个测定法制备适当的Pierce™Luciferase双测定工作溶液,将50μl/孔注射到每个孔中,以终体体积为70mL /孔。通过具有1秒集成时间的适当过滤器读取发光。可以在线找到更详细的协议。过滤器设置的概述在表1中给出。


表1:用于每种双光谱荧光素酶测定的过滤器设置。

测定 荧光素酶 过滤器 获得
Cypridina-Firefly 胞质泳装(紫色图) 475 +/- 30. 2500
红色萤火虫 610长期通过 2000年
高斯萤火虫 高斯(蓝图形) 475 +/- 30. 2500
红色萤火虫 610长期通过 2000年
Renilla-Firefly Renilla(绿色图) 515 +/- 30. 2000年
红色萤火虫 670 +/- 10. 3000.

成绩与讨论

使用适当的过滤器(图2,3和4),测量Pierce™Luciferase Dual-ScresceSteasay试剂盒中的三对荧光素酶报告酶中的每一个的单独信号。

通过在每对中的荧光素酶中选择过滤器,该过滤器消除或大大减少它们之间的干扰,可以发现每个双色测定系统的条件,为每个记者(图2和3)提供10万倍浓度范围内的精确测量。

滤波器选择对于在报告者之间存在频谱重叠时,对于消除干扰至关重要(图1)。因此,为此Renilla.-Firefly测定,我们使用了次优红移位的670 +/- 10nm带通滤波器,用于检测红色萤火虫,这最大限度地减少了绿色的干扰Renilla.。结果,仅在绿色输出时才观察到干扰Renilla.从红色萤火虫的大大大大大(图4)。在该区域中分离频谱数据,需要校正计算(参见Pierce™双光谱计算器)。

结论

这些实验证实了BMG Labtech的微孔板读者测量探测器的德赢vwin官网客服两种荧光素酶活性的能力。当使用适当的过滤器测量时,Thermo Scientific™Pierce™Luciferase Dual-Spectioner测定在每个荧光素酶的至少100,000倍的稀释范围内敏感。定义在双荧光素酶测定中的检测极限是困难的,并且将取决于荧光素酶浓度,因为动态范围将达到荧光素酶浓度。

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