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使用高吞吐量荧光DNA / RNA定量简化下一代测序质量管理

UlrikeBönischlaura Arrigoni Diana Santacruz Nadia Kress 深度测序设施,MAX Planck Immunicoology和Epigenetics Freiburg 09/2018
  • flyostar.®Omega微孔板阅读器定量核酸用于NGS应用
  • 荧光核酸量化在高吞吐量中进行
  • 在NGS样品制备的自动工作流动中整合量化

介绍

下一代测序(NGS)技术和应用正在迅速发展,导致采样频率高度增加。通过制备工作流动,核酸的精确流动量核酸是门控样品中的关键Quali Fi阳离子参数之一。鉴于高多样的样本号,这代表了一个主要挑战(图1)。


在这里,我们展示了将量子比特分析与flustar相结合®欧米茄多模板读卡器非常适合于直接影响深度测序实验质量的高通量样品定量。该检测方法快速、准确和直接,可以很容易地包含在自动化文库准备系统中。图1代表了一个典型的、质量控制的NGS工作流。根据测定方法(WGS, ChIP-Seq, RNA- seq等),DNA或RNA分析物进行荧光定量,并评估质量和完整性参数。第二步,构建测序库,并使用荧光测定法验证成功的制备DNA量化结合毛细管电泳。在测序之前,库被汇集起来以方便多路测序,并装载在测序仪器上进行分析。每个库中DNA数量的百分比以及装载在测序仪器上的总DNA数量直接影响到每个测序实验和测序运行的质量,使得在工作流程的任何步骤都可以进行精确的定量。

测定原则

对于各种样品的规格和敏感的FLOMORIC QUATION,QUBT测定试剂盒已成为NGS应用中的金标。核酸量化套件提供FLOOROCHOROOCOROOCHECOOCHECOOCOOCHECOCOOCH结合DSDNA或RNA,随后增强它们的FOREASP。流荧光强度与DSDNA或RNA的量相关,并用于计算核酸浓度。Qubit化学通常直接在Qubit Fl室内的样品管中检测。因此,量子位不能集成到自动工作流中。将反应转移到微孔板上,打开了使用对Qubit Fl荧光染料用于自动核酸量化的可能性。


材料与方法

  • Qubit dsDNA HS Assay (ThermoScientific, Q32854)
  • Qubit RNA HS测定(Thermoscienti Fi C,Q32855)
  • qubitrna br测定(Thermoscienti fi c,q10210)
  • Qubit测定管(Thermoscienti fi C,Q32856)
  • 96孔板,黑色,F底(Greiner Bio-One,655076)
  • qubit.®单管FL uorometer(Thermoscienti fi c)flyostar®ω(BMG L德赢vwin官网客服ABTECH)

实验程序
用相应的Qubit稀释DNA / RNA样品®工作解决方案要么在量子位®测定管或进入96孔微孔板。测量体积适用于包括10μL标准标准和2μL或1μL样品的所有测定体积200μL。在微孔板中,通过使用300μl8沟道移液管将样品和Qubit工作溶液混合。孵育2分钟后,使用FlyoStar Omega多模板读取器(BMG Labtech)或Qubit检测到流动荧光强度德赢vwin官网客服®单管荧光计。在Fluostar omega数据的情况下,将导出为标准Excel。


仪器设置

光学设置 荧光强度,顶级视镜,端点
过滤器

脱氧核糖核酸
例:485
嗯:520

收益:1100

RNA.

前:630-10
EM:670-10.
获得:2600

一般设置 闪光数量 20.
建立时间 0.5秒



成绩与讨论

使用Flyostar Omega酶标读卡器或Qubit量化DNA测序文库和总RNA样品®单管荧光计。平板阅读器测量是重复进行的,技术复制的标准偏差自动计算使用MARS分析软件包。对于DNA和RNA定量,不同荧光检测设备之间的测量结果非常一致(图2)。fluosstar Omega可以实现简单的重复分析,从而提高测量精度。定量分析可以很容易地使用多通道移液来增加吞吐量,并使无缝集成到液体处理系统。

稀缺样品(低体积低浓度)是准确量化的典型挑战。我们将罕见(低输入/低体积)RNA样品的量化与福洛斯塔欧米茄多模板读取器和QUBit进行比较®单管荧光计。虽然Qubit仪器在分析的样品的一小部分中仅测量浓度,但是在所有测量的样品中检测到的RNA浓度(用于测量的样品体积:1μl),展示了优异的敏感性。

结论

NGS样品制备实验室每天都在进行核酸定量分析,但提供足够的通量和精度的技术仍然是一个挑战。


在这里,我们表明,与FLUOSTAR OMEGA多模微相酶读卡器的量子位测定的组合非常适合测量各种核酸并改善与单管FL测量计相比灵敏度,精度和速度。特别是执行自动化高通量样品准备的大型实验室将从这项技术中提供。

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