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BMG Labtech微孔板读卡器使用Discoverx Hithunter Camp HS测定的GPCR药理学研究德赢vwin官网客服

朱莉m.-n.Rarard Stewart E. Mireylees Mark G. Darlison 诺丁汉特伦特大学生物医学和自然科学学院 09/2006
  • 该试验直接测量G蛋白偶联受体(GPCRs)的活性,偶联到G或G.年代蛋白质
  • 测定敏感,可以检测低水平的营养营(适用于表达内源受体的细胞系)
  • 该检测可用于BMG LABTECH的酶标仪德赢vwin官网客服

表的内容

介绍

G-蛋白偶联受体(GPCR)是细胞表面受体,其代表最主要的药物靶标。在刺激这些受体之后,激活细胞内信号传导途径,这导致减少(耦合到G蛋白质)或增加(通过G年代或G.蛋白质在生产细胞内第二信使。测定化合物活性的常用方式是测量营地和钙等第二信使的细胞形成。


的HitHunter®cAMP高灵敏度(HS)检测能够检测低cAMP水平,因此,尤其适用于内源性表达受体水平远低于过表达克隆GPCR的转染细胞的细胞系。


HitHunter®CAMP测定是在体外基于酶片段互补技术(EFC,图1)的竞争免疫测定。

来自细胞裂解物的自由营蛋白分子竞争与标记的酶供体(Ed)蛋白的抗体结合,其含有β-半乳糖苷酶的小肽片段。在没有自由阵营的情况下,ED-CAMP缀合物被CAMP特异性抗体捕获,并且对于酶受体(EA)的互补不可用,从而导致低信号。在存在自由阵营存在下,抗体位点被占据,允许ED-CAMP缀合物与EA补充,形成活性β-半乳糖苷酶;该酶的底物水解产生化学发光信号。产生的信号与抗体结合的自由阵营的量直接成比例。任何与Hithunter一起使用的发光读者®营地HS测定必须足够敏感,以检测营地水平的少量变化。德赢vwin官网客服BMG Labtech介质读者具有这种必需的灵敏度。


本应用笔记的目的是检测在缺乏和存在受体拮抗剂的情况下激动剂刺激细胞后cAMP水平的变化。本研究采用内源性表达腺苷A的大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞系2AA.2B.受体。在这里,我们利用了一个选择性的化合物2A受体。


材料与方法

HitHunter®cAMP HS试剂盒试剂(DiscoverX):

  • 裂解缓冲液和抗体混合物
  • ED试剂
  • EA试剂和CL基板混合物
  • 营地标准(0.25毫米)

其他试剂和材料:

  • 大鼠PC12 Phaeochrom细胞瘤细胞系(ATCC)
  • Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(PBS; Cambrex)
  • 微孔板,小体积,白色透明底,组织培养处理,无菌,96孔(康宁)
  • 受体激动剂(CGS21680;Tocris)
  • 拮抗剂(ZM241385;Tocris)
  • IBMX(σ;可选)

完整描述了哈希特的使用®试剂盒包含cAMP检测。采用小体积96孔微孔板。


将试剂盒中提供的cAMP标准品以1 / 25稀释至最高工作浓度,再以1 / 3连续稀释的PBS溶液配制成标准曲线,浓度范围为2.7 × 10-6m到4.6×10-11M营地的最终测定体积为55μL。单独使用PBS作为对照。使用PC12细胞也使用PBS来测量由组成型受体活性(基础活性)产生的阵营。


测定方案(低卷96孔板):
在实验之前将PC12细胞接种48小时,以每孔20,000个细胞密度。

1.添加营地标准空孔稀释(15 μL)
2.从细胞中删除介质并重新悬浮美国公共电视台含500μM IBMX (10 μL)
3.添加拮抗剂到细胞(5μl)
4.37℃孵育15分钟
5.添加受体激动剂到细胞(5μl)
6.37℃孵育30分钟
7.添加10μl裂解缓冲液和抗体混合物每一个好
8.室温孵育60分钟
9.加入10μlED试剂每一个好
10.在室温下孵育60分钟
11.加20 μL的EA试剂和CL基板混合物每一个好
12.室温孵育至少60分钟

最后一种试剂加入4小时后,在BMG LABTECH酶标仪上读取化学发光。德赢vwin官网客服


德赢vwin官网客服BMG LABTECH microplate阅读器设置:
发光板模式检测的基本参数如下:

读取模式: 盘子
定位延迟: 0.2秒
不。动态的窗口: 1
不。的multichromatics 1
发射过滤器: 镜头
获得: 3300-3600(视读者而定)
测量间隔时间: 1秒

结果与讨论

的HitHunter®来自Discoverx的CAMP HS测定以96孔格式使用,并从标准和激动曲线曲线的数据从BMG Labtech微孔板读取器中的发光模式获得。德赢vwin官网客服根据制造商的方案加入试剂,加入最后一次试剂后4小时阅读化学发光。使用MARS数据分析软件和软件包GraphPad Prism进行评估数据。

图2为96孔发光检测得到的cAMP标准曲线。曲线显示出剂量依赖性的增加,良好的信号-背景噪声(S/B)值为11。选择性A的剂量-响应曲线2A受体激动剂CGS21680单独或在A的存在2A产生受体选择性拮抗剂ZM241385(图3)。

在10的存在下观察到激动剂剂量响应曲线的向右转移和最大反应的降低-7M ZM241385。这表明ZM241385非竞争性拮抗(4- 5倍)激动剂诱导的细胞内cAMP水平增加。


结论

的HitHunter®CAMP HS测定特别适用于检测营地水平的小变化,例如在大鼠PC12 Phaeochromocytoma细胞系列中看到的那些。可以与BMG Labtech微孔板读卡器一起生成激动剂和拮抗剂数据。德赢vwin官网客服

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