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使用克拉克罗斯塔加上reliostar plus实时研究病毒复制的分子机制

Marko Noerenberg(1)Vincenzo Ruscica(2)Alfredo Castello(1,2 *) (1) MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 464 Bearsden Road, Glasgow G61 1QH, Scotland (UK 11/2020
  • 一种基于荧光的方法,用于近实时测量病毒基因表达
  • 可以用来以96或384-井格式研究几乎任何病毒
  • 高再现性和灵敏度使其适用于遗传和药物筛网

表的内容

介绍

病毒是可感染所有生物体的细胞内病原体。由于它们与几种人类疾病的联系,它们不仅承担了最大的医学相关性,但由于医疗治疗所需的成本和保护牛和作物,它们也具有主要的经济影响。病毒编码有限数量的蛋白质,因此它们相互作用和劫持宿主手机机器以促进其复制和传播。因此,了解宿主病毒相互作用对揭开不抑制感染的分子机制以及新治疗的发展至关重要。随着在过去十年中的“OMICS”的出现,已知的宿主病毒相互作用已经大规模扩展,呼吁新颖的方法以系统的方式测试细胞蛋白质在病毒感染中的重要性。而且,发现的发现抗病毒经常依赖于大型文库的大型化合物的屏幕,这也构成了技术挑战。因此,为了测试病毒感染中细胞蛋白的重要性,并发现新的抗病毒,需要稳健和效果的高通量方法来测量病毒纤维,而不使用廉价试剂如荧光素。


在这里,我们描述了使用Florescesce作为感染代理的近实时分析病毒基因表达的方法。该测定不仅可以发现给定的条件抑制或增强病毒感染,还可以在其对感染动力学的影响中提供见解。


测定原理

本应用说明说明了一种利用BMG LABTECH荧光技术监测病毒基因表达的方法德赢vwin官网客服www.v66088.com 标与www.vw011.com 。作为一个说明性的例子,我们采用了Sindbis病毒(SINV, Alphavirus属),该病毒具有包含mCherry荧光蛋白编码序列的工程基因组。mCherry的表达可以作为病毒基因表达的代理,并且可以在整个感染过程中定期检测。虽然以SINV为例,但这种方法已成功应用于包括人类免疫缺陷病毒(HIV)在内的广泛病毒。


材料与方法

  • 96孔微孔板,液体底部(Greiner Bio-One)。该方案也与384孔微孔板兼容。
  • 无色DMEM培养基
  • Sinv-mcherry病毒库存(〜5x108.pfu / ml)
  • 德赢vwin官网客服BMG Labtech Clariostar加上麦铂读卡器

实验程序
HEK293细胞在96孔微孔板中以5×10 4个细胞的密度接种,含有μt底部。使用SINV-MCHERRY在0.1多种感染(MOI)下进行感染,并在37℃下将细胞用5%CO温育2在Clariostar.板读者24小时。孵育时间应适应每个病毒的生命周期(例如,艾滋病毒72小时)。通过检测来自MCHERRY的红荧光信号(激发:570nm,发射:620nm)来监测病毒基因组表达,每15分钟测量。在开始板读数器中的程序之前或之后,可以进行药物或其他试剂(例如干扰素)。


仪器设置

光学设置 过滤器 激励570-15
二向色593.8
排放620 - 20
焦点 4.4毫米
获得 2900
常规设置 闪光数量 8.
沉淀时间 0秒
扫描设置 轨道平均
扫描直径 4毫米
动态设置 周期数 92.
周期 900秒
孵育37°C,5%CO2

结果与讨论

为了评估病毒基因组复制,我们感染了WT(野生型),XRN1 +/-(部分敲除)和XRN1 - / - (完全敲除)每15分钟监测红细胞蛋白,每15分钟监测红氟荧光蛋白每15分钟24小时监测24小时Clariostar.微孔板读者。感染后24小时的每15分钟检测到每15分钟(HPI)足以涵盖SinV感染的早期和晚期。在HEK293 WT细胞中,在随后的恒定增加(Fi Gure 2),在约8hPI下检测Sinv基因表达。在完全缺乏XRN1的细胞中,病毒基因表达下降到背景水平。这些结果重复XRN1是Sinv感染的关键宿主因子,并且缺乏它导致细胞变得难以感染1(图2)。

该检测的高灵敏度允许以一种非常可重复的方式对中间表型进行分析。例如,当XRN1部分耗尽时,SINV感染被延迟,但没有被完全抑制1(图2)。


此外,该测定允许测试对病毒效率的药物影响。例如,Fi Gure 3显示环孢菌素A,环托蛋白A(PPIA)的已知抑制剂,适度延迟SINV基因表达至PPIA的相当水平(FI Gure 3,底部面板)。该示例突出了该应用筛选蛋白质和药物对病毒基因表达的潜力的潜力。

结论

使用CLARIOstar和CLARIOstar可以成功地进行病毒适应度测定对ACU的FORORECEGECTOPER读卡器允许实时研究多孔板中的病毒基因表达,最多可感染72小时。该方法允许同时筛选广泛的实验条件,例如药物文库和病毒感染中的细胞系。


参考文献

1. Garcia-Moreno,M.等。RNA结合蛋白的系统范围内延伸揭示病毒感染的关键调节剂。Mol Cell,DOI:10.1016 / J.MOLCE.2019.01.017(2019)。

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