ACU的Clariostar将细胞暴露于缺血再灌注条件并监测它们的氧合

介绍

缺氧缺乏与诸如中风，心肌梗死或肾衰竭等危及生命的疾病有关，其中细胞暂时被剥夺了o₂和营养素（缺血）。在再灌注相期间，通过氧化应激和氨态反应也可以发生显着细胞损伤。调查这些病理学体外需要一种能够快速脱氧，快速再灌注和对包括细胞氧合和ROS的关键生物学参数的快速监测的实验组。这里提出的缺血再灌注模型使用具有软件控制的可编程O的酶标器₂和co.₂调节（图1）与MITOxPRESS帧内，（Agilent Technologies）组合，其能够实时监测细胞氧合。使用HepG2细胞和IPS衍生的心肌细胞（Cor.4u^®，公理化）。

材料与方法

• 清除96孔板（Sarstedt）
• 抗霉素A（1μm）和FCCP（2.5μm）
• 二氢丙酮（DHE）（Sigma Aldrich）
• JC-1（Cayman Chemical）

实验程序
Hepg2细胞以25,000个细胞/孔的密度镀，并过夜返回培养物。Cor.4u细胞（均匀性）被镀层并根据制造商的说明进行镀层。

• 细胞氧合：将细胞与细胞内o一起装载过夜₂根据制造商的说明探测脉塔内部（安捷伦技术），并使用下面详述的设置在ClarioStar微孔板读卡器上测量。用于自动o的预配置调节协议和数据分析模板₂BMG Labtech软件上有浓度计算，允许对蜂窝氧合的实时监测。德赢vwin官网客服
• 线粒体膜电位（MMP）：根据制造商的指示在测量之前用JC-1（Cayman Chemical）将细胞加载30分钟，并使用下面详述的设置几次测量。MMP的耗散减少了J-骨料形成，导致骨料的减少：单体比例。
• 反应性氧（ROS）：在测量之前用2.5μmdhe（sigma Aldrich）加载细胞30分钟，并使用下面详述的设置测量。

仪器设置

尿滤灰内
视镜设置	时间分辨荧光，底光学
	过滤器	刺激ex 二向量LP TR. 发射645-20.
	获得	2300
	多种多数：2个集成窗口
	窗口1开始30μs，时间30μs
	窗口2启动70μs，时间30μs
常规设置	闪光灯100号
	建立时间0.1 s
孵化	37℃
大气控制	从房间减少o21％，50分钟，1％o2，增加O.2回到房间

带JC-1的线粒体膜电位
视镜设置	荧光强度，顶视音
	单色仪		激励485-15 485-15 二郎奇541 511. 发射595-10 535-10
	获得1950年
常规设置	闪光灯100号
	建立时间0.1 s

用DHE的活性氧
视镜设置	荧光强度，端点，顶视音
	单色仪		激励510-15 二郎奇560. 发射615-25
	获得1700.
常规设置	闪光号码60
	建立时间0.1s.

成绩与讨论

Clariostar介质读者配备了软件控制的可编程O.₂和co.₂调节与MITOxPRESS内部氧气测定结合使用，以诱导定义缺血再灌注事件体外使用肝脏和心脏模型（分别为hepg2和cor.4u细胞）图3显示了可实现的精确大气控制，具有o₂减少到1％，维持在这种浓度以进行预先定位，然后迅速增加到18％。暗位血管压缩的平行监测揭示了实时氧化监测的重要性，因为细胞呼吸源强调在细胞单层施加氧气浓度。

抗霉素处理的HepG2细胞（无呼吸），再生仪器条件（ACU）然而，呼吸细胞经历了更低的静息氧浓度和更深的缺氧。大气和蜂窝o之间这种差异₂通过FCCP处理（未替换细胞）增加呼吸时进一步增加。因此，使用实时氧化监测，可以调制ACU参数以实现所需的蜂窝缺血再灌注程序。

还使用具有MMP和ROS的平行监测的IPS衍生的心肌细胞（Cor.4U细胞）评估该方法（图4）。非呼吸细胞重新进一步，同时呼吸细胞体验显着减少o₂浓度。

ClarioStar的方便多路复用功能用于平行测量MMP和细胞氧合。使用DHE在相同的文本板上进行ROS测量。抗霉素处理阻断呼吸活动增加细胞氧合的环境水平（图4A），同时也导致MMP耗散（图4B）并增加ROS产生返回（图4B）。