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ACU的Clariostar将细胞暴露于缺血再灌注条件并监测它们的氧合

Andrea Krumm(1)C. Carey(2)M. Schwalfenberg(3)J. Hynes(2)R. Kettenhofen(3) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech GmbH,Ortenberg(2)安捷伦科技,科克,爱尔兰(3)Ncardia,科隆,德国 07/2017
  • 大气控制单元的氧气升高有助于控制细胞中的缺血性和再灌注损伤
  • 细胞内探针在缺血再灌注循环期间追踪细胞氧合
  • 对ROS和MMP探针的并行监测允许详细的缺血再灌注表征缺血性表征

介绍

缺氧缺乏与诸如中风,心肌梗死或肾衰竭等危及生命的疾病有关,其中细胞暂时被剥夺了o2和营养素(缺血)。在再灌注相期间,通过氧化应激和氨态反应也可以发生显着细胞损伤。调查这些病理学体外需要一种能够快速脱氧,快速再灌注和对包括细胞氧合和ROS的关键生物学参数的快速监测的实验组。这里提出的缺血再灌注模型使用具有软件控制的可编程O的酶标器2和co.2调节(图1)与MITOxPRESS帧内,(Agilent Technologies)组合,其能够实时监测细胞氧合。使用HepG2细胞和IPS衍生的心肌细胞(Cor.4u®,公理化)。

材料与方法

  • 清除96孔板(Sarstedt)
  • 抗霉素A(1μm)和FCCP(2.5μm)
  • 二氢丙酮(DHE)(Sigma Aldrich)
  • JC-1(Cayman Chemical)

实验程序
Hepg2细胞以25,000个细胞/孔的密度镀,并过夜返回培养物。Cor.4u细胞(均匀性)被镀层并根据制造商的说明进行镀层。

  • 细胞氧合:将细胞与细胞内o一起装载过夜2根据制造商的说明探测脉塔内部(安捷伦技术),并使用下面详述的设置在ClarioStar微孔板读卡器上测量。用于自动o的预配置调节协议和数据分析模板2BMG Labtech软件上有浓度计算,允许对蜂窝氧合的实时监测。德赢vwin官网客服
  • 线粒体膜电位(MMP):根据制造商的指示在测量之前用JC-1(Cayman Chemical)将细胞加载30分钟,并使用下面详述的设置几次测量。MMP的耗散减少了J-骨料形成,导致骨料的减少:单体比例。
  • 反应性氧(ROS):在测量之前用2.5μmdhe(sigma Aldrich)加载细胞30分钟,并使用下面详述的设置测量。

仪器设置

尿滤灰内
视镜设置 时间分辨荧光,底光学
过滤器 刺激ex
二向量LP TR.
发射645-20.
获得 2300
多种多数:2个集成窗口
窗口1开始30μs,时间30μs
窗口2启动70μs,时间30μs
常规设置 闪光灯100号
建立时间0.1 s
孵化 37℃
大气控制 从房间减少o21%,50分钟,1%o2,增加O.2回到房间

带JC-1的线粒体膜电位
视镜设置 荧光强度,顶视音
单色仪 激励485-15 485-15
二郎奇541 511.
发射595-10 535-10
获得1950年
常规设置 闪光灯100号
建立时间0.1 s

用DHE的活性氧
视镜设置 荧光强度,端点,顶视音
单色仪 激励510-15
二郎奇560.
发射615-25
获得1700.
常规设置 闪光号码60
建立时间0.1s.

成绩与讨论

Clariostar介质读者配备了软件控制的可编程O.2和co.2调节与MITOxPRESS内部氧气测定结合使用,以诱导定义缺血再灌注事件体外使用肝脏和心脏模型(分别为hepg2和cor.4u细胞)图3显示了可实现的精确大气控制,具有o2减少到1%,维持在这种浓度以进行预先定位,然后迅速增加到18%。暗位血管压缩的平行监测揭示了实时氧化监测的重要性,因为细胞呼吸源强调在细胞单层施加氧气浓度。

抗霉素处理的HepG2细胞(无呼吸),再生仪器条件(ACU)然而,呼吸细胞经历了更低的静息氧浓度和更深的缺氧。大气和蜂窝o之间这种差异2通过FCCP处理(未替换细胞)增加呼吸时进一步增加。因此,使用实时氧化监测,可以调制ACU参数以实现所需的蜂窝缺血再灌注程序。


还使用具有MMP和ROS的平行监测的IPS衍生的心肌细胞(Cor.4U细胞)评估该方法(图4)。非呼吸细胞重新进一步,同时呼吸细胞体验显着减少o2浓度。


ClarioStar的方便多路复用功能用于平行测量MMP和细胞氧合。使用DHE在相同的文本板上进行ROS测量。抗霉素处理阻断呼吸活动增加细胞氧合的环境水平(图4A),同时也导致MMP耗散(图4B)并增加ROS产生返回(图4B)。

结论

具有ACU的ClarioStar酶标器读卡器有助于精确的可编程控制o2和co.2,使模拟缺氧侮辱的虚线深度和持续时间,而主动通风可以快速受控再灌注。使用Mitoxpress Intra结合预配置数据分析模板来实现实时氧气监测。批判性地,这允许对ACU参数进行调制,使得在蜂窝水平,所需的深度和缺氧损伤的持续时间,并且实现所需的再灌注速率。在缺血再灌注事件期间/之后,可以执行诸如MMP和ROS之类的密钥蜂窝参数的多参数分析。


参考

1. Hynes J,等方法Mol Biol。,1264:203-17。
2. Chapple S.J.,等,Al 2016.免费Radic。BIOL。Med。,92:152-162

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