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采用ACU的CLARIOstar将细胞暴露在缺血-再灌注状态下,并监测它们的氧合

Andrea Krumm (1) C. Carey (2) M. Schwalfenberg (3) J. Hynes (2) R. Kettenhofen (3) (1)B德赢vwin官网客服MG Labtech GmbH,Ortenberg(2)安捷伦科技,科克,爱尔兰(3)Ncardia,科隆,德国 07/2017
  • 大气控制单元的增氧有助于控制细胞缺血和再灌注损伤
  • 细胞内探针跟踪缺血-再灌注周期中的细胞氧合
  • ROS和MMP探针的并行监测允许缺血-再灌注的详细代谢特征

表的内容

介绍

缺氧与许多危及生命的疾病有关,如中风、心肌梗塞或肾功能衰竭,细胞暂时缺乏氧2和营养(缺血)。在再灌注阶段,氧化应激和炎症反应也会导致显著的细胞损伤。调查这些病态体外需要一种能够快速脱氧,快速再灌注和对包括细胞氧合和ROS的关键生物学参数的快速监测的实验组。这里提出的缺血再灌注模型使用具有软件控制的可编程O的酶标器2和有限公司2调控(图1)与MitoXpress Intra结合,(安捷伦技术),使实时监测细胞氧合。使用HepG2细胞和iPS来源的心肌细胞(Cor.4U®Axiogenesis)。

材料与方法

  • 透明96孔板(Sarstedt)
  • 抗霉素A(1µM)和FCCP(2.5µM)
  • 二氢丙酮(DHE)(Sigma Aldrich)
  • JC-1(Cayman Chemical)

实验程序
Hepg2细胞以25,000个细胞/孔的密度镀,并过夜返回培养物。Cor.4u细胞(均匀性)被镀层并根据制造商的说明进行镀层。

  • 细胞氧化:细胞用细胞内O装载过夜2根据制造商的说明探测MitoXpress Intra(安捷伦技术),并使用下述详细设置在CLARIOstar microplate阅读器上进行测量。预配置的测量协议和数据分析模板的自动O2BMG Labtech软件上有浓度计算,允许对蜂窝氧合的实时监测。德赢vwin官网客服
  • 线粒体膜电位(MMP):按照制造商的说明,在测量前30分钟用JC-1 (Cayman Chemical)装载细胞,并使用下面详细的设置进行比率测量。MMP的耗散减少了j -骨料的形成,从而降低了骨料:单体的比例。
  • 活性氧(ROS):在测量之前,用2.5µM DHE (Sigma Aldrich)加载细胞30分钟,并使用如下详细设置进行测量。

仪器设置

MitoXpress内部
光学设置 时间分辨荧光,底部光学
过滤器 激发TR交货
二向色LP TR
排放645 - 20
获得 2300
好多色:2个集成窗口
窗口1开始30µ秒,时间30µ秒
窗口2开始70µ秒,时间30µ秒
一般设置 闪光灯100号
设定时间0.1 s
孵化 37°C
大气控制 从O室还原2至1%,在1%氧下50分钟2,增加O.2回到房间

线粒体膜电位与JC-1
光学设置 荧光强度,顶部光学
单色仪 激励485-15 485-15
二向色541 511
排放595 - 10 535 - 10
获得1950
一般设置 闪光灯100号
设定时间0.1 s

和DHE反应的活性氧
光学设置 荧光强度,端点,顶视音
单色仪 励磁510 - 15
二向色560
发射615-25
获得1700.
一般设置 不。闪光的60
沉淀时间0.1秒

结果与讨论

CLARIOstar微孔板读卡器配有软件控制的可编程O2和有限公司2调控与MitoXpress细胞内氧分析联合使用来诱导缺血再灌注事件体外使用肝脏和心脏模型(分别为HepG2和Cor.4U细胞),图3显示了可以实现的精确大气控制,O2降低到1%,在这个浓度下维持一段时间,然后迅速增加到18%。平行监测内MitoXpress揭示了实时氧合监测的重要性,因为细胞呼吸显著影响细胞单层的氧浓度。

抗霉素处理的HepG2细胞(无呼吸作用),反映仪器条件(ACU),然而呼吸细胞经历更低的静息氧浓度和更深更持久的缺氧。大气氧和细胞氧之间的差异2当FCCP处理增加呼吸作用时进一步增加(未偶联细胞)。通过实时氧合监测,ACU参数可以被调节以达到预期的细胞缺血-再灌注状态。


采用ips衍生的心肌细胞(co . 4u细胞)并并行监测MMP和ROS对该方法进行评估(图4)。非呼吸细胞反映ACU情况,而呼吸细胞的O显著降低2浓度。


利用CLARIOstar方便的多路复用功能,并行测量MMP和细胞氧合。使用DHE在同一文本板上进行ROS测量。抗霉素治疗阻断呼吸活动,使细胞氧合增加到环境水平(图4A),同时也导致MMP耗散(图4B)和增加ROS生成返回(图4B)。

结论

带有ACU的CLARIOstar微孔板读卡器便于两者的精确可编程控制2和有限公司2,可模拟一定深度和持续时间的缺氧损伤,而主动通气可实现快速控制的再灌注。实时氧合监测使用MitoXpress Intra结合预先配置的数据分析模板实现。重要的是,这允许对ACU参数进行调节,以便在细胞水平上,达到所需的缺氧损伤深度和持续时间,以及所需的再灌注率。在缺血再灌注期间/之后可以对关键细胞参数如MMP和ROS进行多参数分析。


参考文献

1. Hynes J,等方法Mol Biol。,1264:203-17。
2.Chapple S.J等,2016。自由·拉迪奇。医学杂志。地中海,92:152 - 162

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